陳連旭 綜述 于長(zhǎng)隆審閱
北京大學(xué)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所，北京100083
摘要：RNA干涉(RNA interference)是指由特定雙鏈RNA（dsRNA）引起的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象,是目前分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究熱點(diǎn)，為人們研究基因功能提供了一個(gè)有力工具。siRNA(small interference RNA)是RNAi的起始誘導(dǎo)物，在細(xì)胞內(nèi)引起強(qiáng)烈的RNAi,降解目的基因的mRNA，以控制目的基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子NF-kB是介導(dǎo)許多免疫和炎癥的中心物質(zhì) ，在介導(dǎo)骨性關(guān)節(jié)炎形成的許多細(xì)胞因子中，發(fā)揮關(guān)鍵的作用 。本文只在回顧近來在RNAi,NF-kB和骨性關(guān)節(jié)炎中細(xì)胞因子的研究進(jìn)展，探討RNAi技術(shù)應(yīng)用骨性關(guān)節(jié)炎的治療。
關(guān)鍵詞： siRNA；NF-kBp65；基因治療；骨性關(guān)節(jié)炎；細(xì)胞因子
一、RNAi技術(shù)
RNA是生物體內(nèi)最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，它與DNA和蛋白質(zhì)一起構(gòu)成了生命的框架。最近因其能干涉生物基因表達(dá)而頗受矚目，并且由此而引發(fā)的RNA干擾。RNAi(RNA interference)即RNA干擾，自從1998 年被闡明以來，一直是分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究熱點(diǎn)。從植物、真菌到線蟲乃至哺乳動(dòng)物和人類，RNAi研究方興未艾。
RNAi的發(fā)現(xiàn)
早在10多年前，植物學(xué)家在研究轉(zhuǎn)基因植物時(shí)就發(fā)現(xiàn)，部分外源基因?qū)胫参锖?，不但未能正常表達(dá)，植物自身的等位基因表達(dá)也受到抑制，即所謂共抑制（cosupression）現(xiàn)象。此后，在酵母菌和線蟲研究中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，稱之為緩解（quelling）。這種基因抑制是發(fā)生在轉(zhuǎn)
錄后水平的，因此又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcription gene silencing PTGS)[1]。Fire等［2］在利用反義RNA進(jìn)行線蟲基因阻斷時(shí)，發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA能夠引起mRNA降解，而且這一效應(yīng)是基因特異性的。此后，越來越多研究證實(shí)，共抑制、緩解和轉(zhuǎn)錄后基因沉默，都存在由雙鏈RNA 介導(dǎo)mRNA降解的共同機(jī)制—-在生物體內(nèi)，當(dāng)外源性或內(nèi)源性雙鏈RNA（double-stranded RNA dsRNA）進(jìn)入細(xì)胞后，識(shí)別含有其互補(bǔ)序列的RNA并與之結(jié)合后，在酶的作用下降解mRNA，從而干擾相應(yīng)基因表達(dá)。Fire將這一現(xiàn)象稱為RNA interference(RNAi)。這是一種廣泛存在于生物界的古老的現(xiàn)象，早在動(dòng)植物分化之前的生物體內(nèi)就已經(jīng)產(chǎn)生了。RNAi在生物抵御病毒感染，維持基因組中轉(zhuǎn)座子的穩(wěn)定以及某些生物生殖細(xì)胞的發(fā)育過程中都起著重要作用。
RNAi的分子機(jī)制
隨著研究的深入，科學(xué)家對(duì)于RNAi的發(fā)生機(jī)制已達(dá)成了初步共識(shí)：外源性（如病毒）或內(nèi)源性的dsRNA在細(xì)胞內(nèi)與一種RNA酶3（RNAase 3 endonucleasee）—Dicer結(jié)合，隨即被切割成21-23 nt的，帶有3’端單鏈尾巴及磷酸化的5’端的21-23 nt的短鏈dsRNA，是RNAi的起始誘導(dǎo)物，即siRNA（small interference RNA）。siRNA與Dicer形成RISC復(fù)合體（RNA induced silencing complex)。siRNA作為引導(dǎo)序列，按照堿基互補(bǔ)原則識(shí)別靶基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA，并引導(dǎo)RISC復(fù)合體結(jié)mRNA。隨后siRNA與mRNA在復(fù)合體中換位，核酸酶Dicer將mRNA切割成21-23 nt的片段，特異性地抑制靶基因的表達(dá)。而新產(chǎn)生的雙鏈RNA片段可再次形成RISC復(fù)合體，繼續(xù)降解mRNA，從而產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)。因此，每個(gè)細(xì)胞只需要幾個(gè)siRNA分子就能夠引起強(qiáng)烈的RNAi效應(yīng)[3]。此外，siRNA還可以在RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase RDRp）的作用下進(jìn)行大量擴(kuò)增，并轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，使siRNA擴(kuò)散到整個(gè)機(jī)體并可以傳代[4]。
RNAi作用機(jī)制示意圖：
RNAi與基因功能研究
人工誘導(dǎo)RNAi技術(shù)的建立，為人們提供了一種高效的基因功能研究方法。有人將綠色熒光蛋白基因（green fluorescent protein GFP）導(dǎo)入斑馬魚胚胎后，通過顯微注射將針對(duì)GFP序列的dsRNA注入細(xì)胞，結(jié)果GFP基因受到抑制，而同時(shí)轉(zhuǎn)入的其他基因不受影響。注入針對(duì)控制脊索或眼睛發(fā)育基因的dsRNA后，胚胎發(fā)育成無尾或無眼的斑馬魚。這說明在脊椎動(dòng)物中，內(nèi)源和外源性基因都可以被其同源的dsRNA特異性抑制，并產(chǎn)生基因缺失表型。Tuschl實(shí)驗(yàn)組將體外構(gòu)建的dsRNA分別導(dǎo)入Hela細(xì)胞（人類宮頸癌細(xì)胞）、大鼠成纖維細(xì)胞和小鼠3T3細(xì)胞，分別抑制了哺乳動(dòng)物L(fēng)aminB1,LaminB2,NUP153,GAS41,ARC21,cdk1,b-actin和r-actin，等21個(gè)不同類型基因，均獲得成功，并重新界定了部分必須基因和非必須基因[5]。RNAi抑制作用有嚴(yán)格的序列特異性，即使一個(gè)堿基的錯(cuò)配，也會(huì)嚴(yán)重影響抑制效果。與傳統(tǒng)的基因功能的研究方法相比，RNAi技術(shù)靈敏、可靠、結(jié)果穩(wěn)定，操作便捷，費(fèi)用相對(duì)較低，很適合用于大規(guī)模篩選，定位新的功能基因。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的RNAi研究
RNAi技術(shù)已成為生物基因功能研究有力工具。然而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，超過30nt的dsRNA會(huì)啟動(dòng)一種自身細(xì)胞毒機(jī)制，使大量mRNA非特異性降解，引起細(xì)胞死亡。為了克服這一障礙，Tuschl和他的同事將體外合成含有19個(gè)堿基對(duì)和2-3 nt的3’端單鏈尾巴的短鏈siRNA，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，成功誘導(dǎo)RNAi。但是，在一些類型的細(xì)胞中，只能對(duì)靶基因產(chǎn)生瞬時(shí)抑制效應(yīng)[6]。于是學(xué)者們構(gòu)建了的以DNA為模板的siRNA表達(dá)載體。將19nt的目的序列及其反向重復(fù)序列插入含有啟動(dòng)子質(zhì)粒染色體，同時(shí)插入作為檢測(cè)標(biāo)志的報(bào)告基因（reportor）如GFP。該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，能夠轉(zhuǎn)錄出含有19個(gè)堿基對(duì)的莖環(huán)狀（發(fā)夾狀）siRNA,誘導(dǎo)RNAi，有效抑制目的基因[7]。表達(dá)載體的方法將合成siRNA的過程轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，不但效率大大提高，而且可以排除RNA酶的干擾，延長(zhǎng)siRNA的半衰期[8]。更重要的，隨著載體質(zhì)粒的復(fù)制、擴(kuò)增，siRNA擴(kuò)散到整個(gè)機(jī)體，基因抑制效果能夠傳代。這一方法的應(yīng)用，使siRNA技術(shù)應(yīng)用，進(jìn)入了新階段。
siRNA與基因治療
與基因替代、反義寡核苷酸治療、細(xì)胞因子基因治療等傳統(tǒng)的基因治療方法相比，siRNA技術(shù)有著無可比擬的優(yōu)勢(shì)。首先，RNAi基因抑制效果確切。微量的siRNA即可使其編碼致病基因產(chǎn)物的含量下降90%以上，達(dá)到剔除（knock-out）的效果。其次，RNAi抑制具有嚴(yán)格的序列特異性，治療的針對(duì)性強(qiáng)，副作用小。在抗病毒研究中，Lee等[9]在HVI-1病毒基因組的rev和tat基因中分別選取21nt的序列為靶點(diǎn)，進(jìn)行RNAi抑制，5d后檢測(cè)HVI-1的p24抗原下降達(dá)90%，細(xì)胞的生長(zhǎng)未受影響。針對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒和丙型肝炎病毒的體外RNAi抑制實(shí)驗(yàn)，也可以顯著降低培養(yǎng)人類細(xì)胞中的病毒滴度。美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室的McCaffray AP 研究組，第一次在活體大鼠體內(nèi)成功誘導(dǎo)了RNAi，使其肝臟內(nèi)的HCV含量平均下降81%[10]。腫瘤是多基因、多因素疾病，單個(gè)癌基因的抑制往往很難達(dá)到治療效果。RNAI技術(shù)能夠同時(shí)抑制多個(gè)不同基因,而且抑制效果互不干擾。此外，RNAi識(shí)別可以精確到一個(gè)核苷酸，對(duì)由野生型點(diǎn)突變形成的癌基因，如ras，p53等，能夠產(chǎn)生準(zhǔn)確有效的封閉效果，野生型基因則不受影響。實(shí)驗(yàn)證明，bcl-2，CDK-2，PLK-1,p53等腫瘤相關(guān)基因的RNAi抑制，能夠使人類宮頸癌細(xì)胞（hela）增殖速度減慢，惡性程度降低，凋亡加快。肝癌（Hep3B）、非小細(xì)胞肺癌（HI299）、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（C33-A）、骨肉瘤（U-2OS）及前列腺癌（LNCaP）[11]、白血病[12]等細(xì)胞系中的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)類似效應(yīng)。此外，將RNAi應(yīng)用于wils0on病等先天遺傳性疾病的體外實(shí)驗(yàn)也獲得令人滿意的結(jié)果[13]。H.W.Zhou等[14]利用siRNA技術(shù)在骨性關(guān)節(jié)炎的軟骨細(xì)胞抑制p16基因，獲得滿意效果，這也是首次在軟骨細(xì)胞中應(yīng)用RNAi技術(shù)，提示我們可以在骨科領(lǐng)域應(yīng)用RNAi技術(shù)。
二、核因子kappaB
核因子kB(nuclear factor kappaB,NF-kB)是1986年由Sen和Baltimore首次從B淋巴細(xì)胞中監(jiān)測(cè)到的一種能與免疫球蛋白k輕鏈基因增強(qiáng)子kB序列特異結(jié)合的核蛋白因子[1]。NF-kB是普遍存在于真核細(xì)胞中的一種快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，在靜息狀態(tài)下與抑制性蛋白IkB結(jié)合并以非活性狀態(tài)存在于胞漿內(nèi)。抑制狀態(tài)的NF-kB對(duì)環(huán)境變化比較敏感，可被多種刺激激活，轉(zhuǎn)入核內(nèi)調(diào)節(jié)一系列基因的表達(dá)。NF-kB對(duì)大量基因的調(diào)節(jié)，在機(jī)體的正常生理狀態(tài)和各種疾病的病理發(fā)生機(jī)制都發(fā)揮著重要的作用。它不僅參與機(jī)體正常的免疫和炎癥反應(yīng)、發(fā)育、細(xì)胞的生長(zhǎng)和調(diào)亡過程，同時(shí)它與癌癥、關(guān)節(jié)炎、哮喘、心血管疾病也有密切的聯(lián)系。
NF-kB的結(jié)構(gòu)
NF-κb是屬于Rel家族的二聚體蛋白，具有300核苷酸的同源結(jié)構(gòu)域：Rel同源結(jié)構(gòu)域(Rel Homology Domain,RHA)，內(nèi)含DNA結(jié)合域、二聚化結(jié)構(gòu)域和核定位信號(hào)（nuclear translocation signal,NLS）區(qū)，分別具有與DNA上的kB序列結(jié)合，與同源或異源亞基形成二聚體，與NF-kB抑制蛋白IkB家族成員相互結(jié)合等功能。大多數(shù)二聚體包括P65（Rel A）和P50兩種蛋白，其他Rel家族的蛋白如：c-ReL,Rel B、v-Rel、P52也有可能以不同的方式跟它結(jié)合。不同形式的二聚體可能選擇激活不同的基因，具有不同的轉(zhuǎn)錄活性。RelA、RelB和c-Rel的C端含有轉(zhuǎn)錄激活域（transactivation domain）,其中富集絲氨酸、酸性氨基酸和疏水性氨基酸，能直接作用與轉(zhuǎn)錄元件而激活轉(zhuǎn)錄過程，而p50和p52無此結(jié)構(gòu)。NF-kB/Rel蛋白家族均以同源或異源二聚體形式存在，其中以p50/RelA最普遍，幾乎存在于所有的細(xì)胞中。p50亞基用于與DNAkB序列結(jié)合，而RelA亞基即可利用其C端的轉(zhuǎn)錄激活域增強(qiáng)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活，又可與各種Ikb成員直接藕聯(lián)[2]。
IkB抑制蛋白家族包括IkBa、IkBb、IkBr、IkBe、p100、p102、Bcl-3和IkB-R[3]。其中IkBa和IkBb時(shí)NF-κB活性的主要調(diào)節(jié)者。它們享有三個(gè)共同的結(jié)構(gòu)特征：都有一個(gè)N末端調(diào)節(jié)域，與信號(hào)誘導(dǎo)的IκB蛋白降解有關(guān)；都有6個(gè)獲7個(gè)錨定蛋白重復(fù)區(qū)，可與RHD結(jié)合而隱藏NF-kB的NLS,從而阻止NF-κB的核移位；IκB的C端富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的羧基末端片斷（PEST）基序，該基序在抑制NF-κB與DNA的結(jié)合中發(fā)揮作用。
NF-κb正常情況下跟阻滯蛋白IκB結(jié)合，以非活性方式存在與細(xì)胞質(zhì)中，IκB分子具有ankryn樣的重復(fù)序列，同不同的Rel蛋白結(jié)合，覆蓋核轉(zhuǎn)錄信號(hào)位點(diǎn)。當(dāng)有外源激活信號(hào)時(shí)，通過一系列酶的作用,IκB磷酸化，脫離多聚體，而使NF-κB暴露轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)而進(jìn)入核內(nèi)，結(jié)合到Rel蛋白的順式作用結(jié)合位點(diǎn)（GGGRNNYYCC），發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用,促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄[4]。轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，NF-kB與新合成的IκB結(jié)合出核并再次失活。外源激活刺激包括：前炎細(xì)胞因子（IL-1β,TNF-α,IL-11,IL-17）、脂多糖，蛋白激酶C、氧化劑、各種病毒及某些理化因素等。NF-κB激活后，快速誘導(dǎo)包括免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)在內(nèi)的多基因表達(dá),主要包括細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-2、IL-11、IL-17)，化學(xué)因子（IL-8等）,炎性酶（iNOs和iCOX-2）、黏附因子（ICAM-1,VCAM-1），生長(zhǎng)因子(VEGF)，凋亡相關(guān)因子p53和某些受體。既然NF-kB可以調(diào)節(jié)IL-1β和TNF-α表達(dá)，也可被它轉(zhuǎn)錄激活，在某些細(xì)胞中隨著NF-κB的慢性激活，可導(dǎo)致前饋性擴(kuò)增。NF-κB不只是單獨(dú)作用，而是跟其他轉(zhuǎn)錄因子如：AP-1、ATF和C/EBP共同作用，擴(kuò)大基因表達(dá)。
靶向性破壞NF-κB的組成元件，在其轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮重要作用，敲除RelA的大鼠不能存活，敲除p50的基因?qū)е聦?duì)感染的易感，破壞IkB導(dǎo)致延長(zhǎng)NF-κB的激活、感染的刺激，動(dòng)物由于廣泛感染而死亡。如果抑制NF-κB的活動(dòng)，可以減輕免疫反應(yīng)和炎性介質(zhì)的釋放，激素、阿司匹林和金制劑都是它的抑制劑，已廣泛應(yīng)用于臨床。拮抗p65的反義寡核苷酸已用于試驗(yàn)和臨床研究中。它能抑制大多數(shù)炎細(xì)胞因子的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，減輕組織破壞。
三、骨性關(guān)節(jié)炎的細(xì)胞因子學(xué)說
近年來的研究表明，細(xì)胞因子和多肽生長(zhǎng)因子不僅在關(guān)節(jié)軟骨和滑膜的正常結(jié)構(gòu)和功能的維持方面起重要作用，而且，一些因子在關(guān)節(jié)炎的病理過程中對(duì)關(guān)節(jié)軟骨和關(guān)節(jié)滑膜也具有一定的破壞作用。在OA發(fā)生中最引人注目的是IL-1β、TNF-α兩種細(xì)胞因子，IL-1β 和TNF-α是關(guān)節(jié)炎病理過程中促進(jìn)軟骨機(jī)制降解和關(guān)節(jié)軟骨破壞的兩種最重要的細(xì)胞因子。大量證據(jù)表明，IL-1b在關(guān)節(jié)炎的病理生理過程中發(fā)揮重要的作用，通過一系列反應(yīng)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎癥和軟骨的破壞[1、2]。在關(guān)節(jié)軟骨中，IL-1可阻止軟骨基質(zhì)蛋白的形成 [3、4]，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶[5]，介導(dǎo)金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）與金屬蛋白酶（MMPs）之間失衡，降解軟骨基質(zhì)成分。還可誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性介質(zhì)，包括前列腺素（PGE）[6]和一氧化氮(NO)[7],導(dǎo)致關(guān)節(jié)的腫脹和疼痛。由誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（iNOS）產(chǎn)生的一氧化氮(NO)在關(guān)節(jié)炎疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要的作用。而阻止一氧化氮的合成，可抑制一些關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[8、9]。在關(guān)節(jié)中，NO主要有軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞產(chǎn)生[10]，對(duì)IL-1β和TNF-α等刺激敏感，這些刺激主要加快iNOS的表達(dá)和合成，以增加NO的產(chǎn)量[12、13]，iNOS蛋白的合成調(diào)節(jié)主要在轉(zhuǎn)錄水平，主要包括NF-kB和AP-1[13-18]。但A. Ferreira Mendes等[19]認(rèn)為，NF-κB和p38是主要的兩條相互獨(dú)立的誘導(dǎo)iNOS表達(dá)的轉(zhuǎn)錄通路，阻止其中的任何一條，都足以阻止iNOS的表達(dá)，減少關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)NO的含量。而前列腺素的增加與COX-2活化有關(guān)，主要與NF-κB調(diào)節(jié)有關(guān)，而干擾其活性可顯著降低COX-2的表達(dá)，進(jìn)一步降低前列腺素的合成[20]。在軟骨組織中，TNF-α選擇性地抑制Ⅱ型和Ⅸ型軟骨膠原的產(chǎn)生，抑制蛋白多糖的合成，同時(shí)促其降解，另外，對(duì)PA、PGE2、和IL-6均有誘導(dǎo)作用，與OA軟骨破壞及滑膜炎有關(guān)。OA軟骨與正常軟骨相比，產(chǎn)生更多的TNF-α和TNF-α轉(zhuǎn)換酶（TNF-alpha convertase enzyme，TACE）mRNA，TACE是TNF-α的活性調(diào)節(jié)劑。從OA關(guān)節(jié)軟骨中分離的軟骨細(xì)胞中p55 TNF 受體(TNF-R)高表達(dá)。在神經(jīng)細(xì)胞中，抑制NF-κBp50可抑制p53和NO的表達(dá)，可抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。有作者認(rèn)為，TNF-α是IL-1β的上游因子，可誘導(dǎo)IL-1β的產(chǎn)生并共同作用，在骨性關(guān)節(jié)炎的早期發(fā)揮作用。
小結(jié)
骨性關(guān)節(jié)炎的主要致病因素使IL-1β和TNF-α,二者都可通過NF-κB轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的通路激活MMPs,iNOS和COX-2,引起軟骨損傷和關(guān)節(jié)炎癥狀。而且還進(jìn)一步反饋增加IL-1β和TNF-α的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。因此應(yīng)用特異性的siRNA阻抑p65蛋白的表達(dá)，從而降低NF-κB的轉(zhuǎn)錄表達(dá)活性，抑制上述炎性介質(zhì)的表達(dá)，達(dá)到治療骨性關(guān)節(jié)炎的目的。同時(shí)在軟骨細(xì)胞中對(duì)NF-kB與p53的凋亡作用也進(jìn)行初步的研究，為下一步的工作創(chuàng)造條件。
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