無血清培養(yǎng)基的出現(xiàn)是培養(yǎng)基發(fā)展歷程上的一個里程碑，其一般是在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，引入成分完全明確的或部分明確的血清替代成分，使培養(yǎng)基能滿足動物細(xì)胞培養(yǎng)的要求，又可有效的克服因使用血清所引發(fā)的問題。進入20世紀(jì)80年代后，新的無血清培養(yǎng)基不斷問世，人們經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，只要在培養(yǎng)基中增加某些適于細(xì)胞生長的成分，如纖連蛋白（fibronectin）、轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin,TRF）、胰島素（Insulin）和表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）等，不少細(xì)胞即能在無血清供應(yīng)的情況下生長，尤其是CHO、雜交瘤、骨髓瘤細(xì)胞以及BHK21細(xì)胞等。某些細(xì)胞在無血清的條件下，其生長和抗體的產(chǎn)量甚至較有血清培養(yǎng)時高出數(shù)倍。
目前，無血清培養(yǎng)基的研究有兩個方向：一是培養(yǎng)基中不含有任何動物來源的添加組分；二是培養(yǎng)基中不含有不明確的添加組分。依此可以將當(dāng)前應(yīng)用較多的無血清培養(yǎng)基歸納為以下四種：
（1)無血清培養(yǎng)基，為一般意義上無血清培養(yǎng)基，用各類可替代血清功能的生物材料配制細(xì)胞培養(yǎng)基，如牛血清白蛋白(BSA) 、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素等生物大分子物質(zhì)，以及從血清中提取的去除蛋白質(zhì)的混合脂類以及水解蛋白等。其特點是培養(yǎng)基中的蛋白含量較高,添加物質(zhì)的化學(xué)成分不明確，其中含有大量的動物來源蛋白。
(2)無動物來源培養(yǎng)基，許多商業(yè)公司開發(fā)的無動物來源培養(yǎng)基是基于生產(chǎn)重組藥物的安全考慮，培養(yǎng)基中的添加組分無動物來源，需要的蛋白來源于重組蛋白或者蛋白水解物，這些組分可以保障細(xì)胞生長及增殖的需要。
(3)無動物蛋白培養(yǎng)基，培養(yǎng)基完全不用動物來源的蛋白，但仍有部分添加物是來源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物。此類培養(yǎng)基組分相對穩(wěn)定，但必須添加類固醇激素和脂類前體，并且對培養(yǎng)的細(xì)胞是高度特異性的。
(4)化學(xué)組分限定培養(yǎng)基，此類培養(yǎng)基是目前最安全、最為理想的培養(yǎng)基，首先可以保證培養(yǎng)基批次間的一致性，其中所添加的少量動物來源的蛋白水解物、蛋白都是成分明確的組份。其特點是培養(yǎng)基的性質(zhì)明確，有利于進行細(xì)胞培養(yǎng)的代謝研究，同時分離純化也比較方便。
無血清培養(yǎng)基種類：
一、CHO：
CHO細(xì)胞是中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957年美國科羅拉多大學(xué)Dr. Theodore T. Puck從一成年雌性倉鼠卵巢分離獲得，為上皮貼壁型細(xì)胞，是目前生物工程上廣泛使用的細(xì)胞系。工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用較多的是CHO-K1細(xì)胞，為轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，細(xì)胞染色體分布頻率是2n＝22，系亞二倍體細(xì)胞。ATCC保存CHO-K1細(xì)胞株，編號為CCL-61，被廣泛地用于重組DNA蛋白的表達。由于該細(xì)胞存在遺傳缺陷，無脯氨酸合成基因，不能將谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼?γ-半醛，培養(yǎng)過程中需在培養(yǎng)基中添加L-脯氨酸才能生長。并且由于該細(xì)胞已經(jīng)霍亂毒素適應(yīng)，形態(tài)學(xué)有所改變。最初細(xì)胞為貼壁型細(xì)胞，經(jīng)多次傳代篩選后，也可懸浮生長。
目前已有多種外源基因如人組織性纖溶酶原激活劑（tPA）、人促紅細(xì)胞生成素（EPO）、乙肝表面抗原（HBsAg）、干擾素γ（IFNγ）、干擾素β（IFNβ）、白細(xì)胞介素2（IL2）、凝血因子Ⅷ等在CHO細(xì)胞中得到表達。在美國已注冊的大約73 種蛋白藥物生產(chǎn)中，應(yīng)用哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的有35 種，CHO 細(xì)胞培養(yǎng)的就占27 種，其中包括10種單克隆抗體。
二、BHK：
BHK21細(xì)胞是幼年敘利亞地鼠腎細(xì)胞（Baby Hamster Syrian Kidney ）。1961 年3 月，I.A.Macpherson 和 M.G.P. Stoker 從一日齡敘利亞地鼠腎分離建株，經(jīng)過84 天連續(xù)培養(yǎng)，獲得單細(xì)胞克隆細(xì)胞，即clone 13 或C13。BHK21 細(xì)胞廣泛用于增殖各種病毒，已成為制備口蹄疫疫苗所需病毒抗原的理想細(xì)胞培養(yǎng)系，應(yīng)用于口蹄疫疫苗生產(chǎn)，之外還可用于生產(chǎn)狂犬疫苗等其它獸用疫苗。BHK21 細(xì)胞染色體分布頻率是n＝44，為異雙倍體細(xì)胞系，4倍體發(fā)生率為4％，大多數(shù)細(xì)胞核型分析為44，XY，-6，-15，6q+，15q+。原始的BHK21 細(xì)胞株為成纖維細(xì)胞，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，后經(jīng)無數(shù)次傳代后細(xì)胞可懸浮生長。美國ATCC保存BHK21細(xì)胞株，編號為CCL-10，為C13 克隆株。對于BHK21細(xì)胞， ATCC 推薦使用的培養(yǎng)方式為：使用含10％胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基進行細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)溫度為37.0°C，細(xì)胞培養(yǎng)后使用0.25％胰酶和0.03％EDTA消化細(xì)胞，細(xì)胞分種比例為1：2－1：10，每周1－2 次細(xì)胞傳代。主要用于口蹄疫疫苗生產(chǎn)。
三、Vero：
Vero細(xì)胞是成年非洲綠猴腎細(xì)胞（Adult African Green Monkey Kidney ）。上皮細(xì)胞，貼壁依賴性生長。該細(xì)胞是日本千葉大學(xué)的Y. Yasumura和Y. Kawakita于1962年3月27日從一只正常的成年非洲綠猴腎組織培養(yǎng)出來的。其可增值多種病毒，如脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病毒、乙腦病毒等，生產(chǎn)疫苗，被批準(zhǔn)用于人體。也可作為轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，用于表達外源基因的蛋白質(zhì)藥物和病毒的檢測。在非典期間又為研究冠狀病毒做出貢獻，在醫(yī)藥研究中廣泛應(yīng)用。美國ATCC保存Vero細(xì)胞株，編號為CCL-81。對于Vero細(xì)胞， ATCC推薦使用的培養(yǎng)方式為：使用含10％胎牛血清的MEM培養(yǎng)基進行細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)溫度為37.0°C，細(xì)胞培養(yǎng)后使用用 0.25% (w/v) 的胰酶和0.53 mM EDTA消化細(xì)胞，推薦的細(xì)胞分種比例為1：4，傳代期間，每周更換培養(yǎng)液2～3次。
Vero細(xì)胞可使用方瓶或轉(zhuǎn)瓶進行細(xì)胞培養(yǎng)，對于生物制藥企業(yè)，多使用15L轉(zhuǎn)瓶進行細(xì)胞培養(yǎng)。轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)制備Vero細(xì)胞的主要問題在于如何避免污染，以及細(xì)胞良好生長與傳代。與原代細(xì)胞以及二倍體細(xì)胞比較，Vero細(xì)胞更容易控制與培養(yǎng)，由于Vero細(xì)胞生長速度較快，可進行大比例分種培養(yǎng)。營養(yǎng)Vero細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)效果的因素較多，比如細(xì)胞消化液的選擇、細(xì)胞培養(yǎng)操作程序的使用，但作為重要的生物制藥原材料，細(xì)胞培養(yǎng)基對細(xì)胞培養(yǎng)效果的重要性得尤為突出。細(xì)胞培養(yǎng)基不僅為細(xì)胞的生長提供必要的各種營養(yǎng)成分，還為細(xì)胞培養(yǎng)提供適宜的環(huán)境，而且，在利用細(xì)胞進行生物制藥時，培養(yǎng)基的成分可直接影響制藥產(chǎn)品的質(zhì)量。Vero細(xì)胞可使用多種細(xì)胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，使用的血清含量通常為10%。Vero 細(xì)胞經(jīng)較低濃度的血清適應(yīng)傳代后，可適應(yīng)低血清濃度而良好的生長，細(xì)胞的生長狀態(tài)和生長速度沒有明顯影響。
四、MDCK
MDCK細(xì)胞系(MDCK Cell Lines)由Madin和Darby于1958年從美國Cocker Spaniel母曲架犬的腎臟組織分離培育建立，通常是以貼壁方式生長的上皮樣細(xì)胞。犬腎上皮連續(xù)細(xì)胞系MDCK (Madin-Daby canine kidney cells) 廣泛用于多種病毒的擴增和純化，如：呼腸孤病毒(Reovius)、腺病毒(Adenovirus)、犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus，CPV)、貓粒細(xì)胞缺乏癥病毒(Feline panleukopenia virus，F(xiàn)PLV)及禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)等。由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易變異，MDCK細(xì)胞系(MDCK Cell Lines)被公認(rèn)為最適于甲、乙型流感病毒疫苗生產(chǎn)的3種細(xì)胞系之一。傳統(tǒng)的MDCK細(xì)胞培養(yǎng)大多采用有血清貼壁培養(yǎng)方式。血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種復(fù)雜混合物，其含有細(xì)胞生長所需的生長因子、激素、載體蛋白、貼壁因子、微量元素 以及其他營養(yǎng)物質(zhì)，可以有效地促進細(xì)胞生長和產(chǎn)物表達。然而，血清的應(yīng)用也存在許多問題：易受病毒、支原體或其他病原體的污染；批間差異造成產(chǎn)品批 次間的質(zhì)量難以嚴(yán)格控制；大量血清蛋白的存在增加了下游分離純化的難度，部分蛋白難以通過分離純化手段徹底去除，影響了產(chǎn)品的最終質(zhì)量；此外，血清 來源困難、價格昂貴，大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中使用血清將會大大增加生產(chǎn)成本。
胚胎冷凍儀 程序降溫儀 (點擊標(biāo)題進入）
MP王牌產(chǎn)品- FastDNA土壤樣品提取試劑盒買五送禮品 （點擊標(biāo)題進入）
細(xì)胞治療使用的 lonza 04-418Q 無血清培養(yǎng)基 （點擊標(biāo)題進入）
專業(yè)有效的細(xì)胞離心涂片系統(tǒng)－－Tharmac® Cellspin 載玻片離心機 （點擊進入）
lonza 無血清培養(yǎng)基 （點擊標(biāo)題進入）
干細(xì)胞治療使用的 lonza 12-725F 無血清培養(yǎng)基 （點擊標(biāo)題進入） |
