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                                    1.        腫瘤細(xì)胞正在“勝利大逃亡” 

去年備受關(guān)注的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，讓“免疫負(fù)調(diào)控”的發(fā)現(xiàn)者詹姆斯·艾利森和本庶佑聲名顯赫。“免疫負(fù)調(diào)控”發(fā)生在抗原呈遞期間，即初始T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞之間傳遞抗原信號(hào)，以及細(xì)胞識(shí)別期間，即效應(yīng)T細(xì)胞遷移進(jìn)入腫瘤組織，與腫瘤細(xì)胞或免疫細(xì)胞之間傳遞識(shí)別信號(hào)期間。

大部分腫瘤細(xì)胞就是充分利用“免疫負(fù)調(diào)控”，來(lái)抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞的免疫活性，從而逃避免疫系統(tǒng)的追殺。具體地說(shuō)，在正常狀態(tài)下，當(dāng)炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，NK細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞，以及表皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)PD-L1蛋白。當(dāng)這些細(xì)胞和被激活的T細(xì)胞接觸時(shí)，PD-L1與T細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合，從而抑制T細(xì)胞的免疫活性，避免過(guò)激的炎癥反應(yīng)對(duì)自身的傷害。因?yàn)檫@些細(xì)胞表面表達(dá)的PD-L1程度比較低，所以可以避免對(duì)T細(xì)胞活性的消耗。然而腫瘤細(xì)胞大不一樣，它們?cè)诩?xì)胞表面大量表達(dá)PD-L1，能夠幾乎完全抑制與它們接觸的所有T細(xì)胞的免疫活性，造成T細(xì)胞活性耗竭，并逃避免疫系統(tǒng)的追殺，最終惡性繁殖擴(kuò)增，危及生命。（圖1）

                                                                                   圖1 ：免疫負(fù)調(diào)控示意圖

 （a）當(dāng)T細(xì)胞對(duì)抗原產(chǎn)生初次響應(yīng)時(shí)，CTLA-4介導(dǎo)的免疫檢查點(diǎn)被誘導(dǎo)激活。這種由CTLA-4介導(dǎo)的誘導(dǎo)激活程度，依賴(lài)于起始T細(xì)胞受體調(diào)整的信號(hào)強(qiáng)度。高親和配體能夠誘導(dǎo)表達(dá)更多的CTLA-4，從而減弱了起始響應(yīng)的強(qiáng)度。當(dāng)T細(xì)胞受體遭遇抗原后，誘導(dǎo)下游通路，CTLA-4被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面，此時(shí)CTLA-4起到信號(hào)減弱的功能，以維持一個(gè)恒定的T細(xì)胞激活水平。（b）與CTLA-4不同，PD-1信號(hào)通路并不在起始T細(xì)胞激活階段起作用，而是在外周組織中，效應(yīng)T細(xì)胞識(shí)別組織中的抗原，以調(diào)節(jié)炎癥響應(yīng)的過(guò)程中。這些組織中的炎癥信號(hào)（IFN-γ，主要由I型輔助T細(xì)胞表達(dá)）能夠誘導(dǎo)組織細(xì)胞中的PD-L1的表達(dá)，從而抑制效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)其免疫響應(yīng)。在慢性抗原暴露的情況下，T細(xì)胞表面過(guò)量誘導(dǎo)的PD-1，可以引發(fā)T細(xì)胞的活性耗竭。（c）在腫瘤細(xì)胞中，PD-L1的表達(dá)或不依賴(lài)于腫瘤微環(huán)境中的炎癥信號(hào)，AKT、STAT3信號(hào)通路的激活可誘導(dǎo)表達(dá)PD-L1，或依賴(lài)于炎癥信號(hào)，表達(dá)下游的免疫檢查點(diǎn)抑制蛋白。

目前，腫瘤的聯(lián)合免疫療法越來(lái)越體現(xiàn)出它的優(yōu)越性。一方面，要減少腫瘤靶向結(jié)合的非特異性，減少治療過(guò)程對(duì)正常細(xì)胞的殺傷，我們需要盡可能地將免疫系統(tǒng)引起的細(xì)胞毒性局限在腫瘤組織中（靶向藥物）。另一方面我們需要解除腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的免疫負(fù)調(diào)控，提高免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性（免疫負(fù)調(diào)控抑制），使腫瘤殺傷單抗藥物的腫瘤殺傷作用更能發(fā)揮威力。

在這些治療方案中，都以T細(xì)胞免疫為核心。雖然細(xì)胞毒性T細(xì)胞的腫瘤殺傷作用具有一定的特異性，然而極優(yōu)而劣。因?yàn)榧?xì)胞毒性T細(xì)胞的特異性，來(lái)源于被殺傷細(xì)胞的MHC-I型抗原遞呈。只有識(shí)別了目標(biāo)細(xì)胞通過(guò)MHC-I遞呈的抗原，細(xì)胞毒性T細(xì)胞才能特異性的殺傷靶細(xì)胞。然而，狡猾的腫瘤細(xì)胞，有相當(dāng)一部分關(guān)閉了其細(xì)胞表面MHC-I類(lèi)分子的表達(dá)，比如，92%的宮頸癌細(xì)胞，71%的乳腺癌細(xì)胞，64%的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞。這樣我們英勇無(wú)比的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，對(duì)它們就無(wú)能為力了。

 “如之奈何？”

 幸運(yùn)的是，對(duì)付這類(lèi)狡猾的腫瘤細(xì)胞，我們有免疫系統(tǒng)的另一殺手，自然殺傷細(xì)胞（Natural Killer Cell， NK細(xì)胞）。

NK細(xì)胞，即自然殺傷細(xì)胞，是一種具有細(xì)胞毒性的淋巴細(xì)胞，屬于天然免疫系統(tǒng)。NK細(xì)胞與獲得性免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，扮演著相近的角色。NK細(xì)胞對(duì)病毒感染的細(xì)胞，或者腫瘤形成，有著極快的響應(yīng)速率。通常情況下，免疫細(xì)胞檢測(cè)到感染細(xì)胞表面的MHC，引起細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而導(dǎo)致靶細(xì)胞裂解或凋亡。但NK細(xì)胞有所不同，它們可以在沒(méi)有抗體或MHC的情況下，識(shí)別這些細(xì)胞并進(jìn)行快速的免疫響應(yīng)。對(duì)于那些失去自身標(biāo)記的MHC-I型的細(xì)胞，NK細(xì)胞不經(jīng)過(guò)激活就可以進(jìn)行殺傷。而這些細(xì)胞通常是有害的，不能被其他免疫細(xì)胞發(fā)現(xiàn)并消滅，比如細(xì)胞毒性T細(xì)胞。（圖2）

                                                                         圖2 NK細(xì)胞的“丟失自我”的殺傷機(jī)制

 NK細(xì)胞通過(guò)自身表面的激活型和抑制型受體，調(diào)節(jié)自身的細(xì)胞毒性，比如殺傷細(xì)胞類(lèi)免疫球蛋白受體。大部分受體不僅表達(dá)在NK細(xì)胞上，也表達(dá)在T細(xì)胞上。抑制型受體識(shí)別并結(jié)合MHC-I，這樣也可以解釋NK細(xì)胞殺傷那些沒(méi)有表達(dá)MHC-I的細(xì)胞。而MHC-I在抗原呈遞過(guò)程中，激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞。但是，當(dāng)被感染或變異的細(xì)胞，逐漸降低表達(dá)MHC-I，使它們自身免于被T細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，規(guī)避T細(xì)胞免疫。而NK細(xì)胞正好彌補(bǔ)了這一點(diǎn)。

盡管NK細(xì)胞并不需要腫瘤相關(guān)抗原識(shí)別，來(lái)調(diào)整抗腫瘤的響應(yīng)，但NK細(xì)胞同樣存在免疫檢查點(diǎn)的激活或抑制機(jī)制。雖然目前在細(xì)胞因子治療方法，以及NK細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移等方面有所進(jìn)步，但是，腫瘤細(xì)胞表達(dá)的針對(duì)NK細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)的配體，仍然能夠抑制NK細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞裂解。于是NK細(xì)胞功能缺失，腫瘤逃逸，病情加劇。因此目前有一些新的藥物被研發(fā)出來(lái)，針對(duì)腫瘤-NK細(xì)胞的抑制型免疫檢查點(diǎn)，以限制這種抑制作用。

當(dāng)細(xì)胞在病毒感染向腫瘤轉(zhuǎn)化期間，產(chǎn)生了應(yīng)激壓力或DNA損傷，就會(huì)產(chǎn)生胚系編碼配體（germ-line ligand），這些配體可以被NK細(xì)胞表達(dá)的胚系編碼受體（germ-line receptor）識(shí)別。而當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)低表達(dá)MHC-I的情況時(shí)，就會(huì)觸發(fā)“丟失自我”殺傷機(jī)制。因此為了最大程度地減少對(duì)正常細(xì)胞或組織的殺傷，必須微妙的平衡這種激活或抑制的信號(hào)，以調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的活性。

NK細(xì)胞表面激活型的受體包括：自然細(xì)胞毒性引發(fā)受體（NCRs）、SLAM家族受體、c型凝集素、CD16（FcγRIII）。例如CD16并不識(shí)別細(xì)胞表達(dá)的配體，而是識(shí)別細(xì)胞結(jié)合的IgG抗體的Fc部分，而且單獨(dú)通過(guò)CD16就足夠引發(fā)強(qiáng)大的激活信號(hào)且克服大部分抑制信號(hào)，引發(fā)NK細(xì)胞-抗體介導(dǎo)的ADCC。另外，C型凝集素的同二聚體NKG2D，識(shí)別細(xì)胞表面因DNA損傷或應(yīng)激壓力而上調(diào)的分子。這些激活型受體結(jié)合配體后，還能引發(fā)細(xì)胞因子比如IFN-γ、TNF-α的分泌，其中IFN-γ可誘導(dǎo)周?chē)?xì)胞MHC-I的表達(dá)，增強(qiáng)CD8+ T細(xì)胞的識(shí)別能力（圖1）。

NK細(xì)胞表面抑制型的受體包括：殺傷細(xì)胞免疫球蛋白類(lèi)似受體（KIRs）、c型凝集素受體（NKG2A/CD94）、白細(xì)胞免疫球蛋白類(lèi)似受體（LILRs）、常見(jiàn)的免疫檢查點(diǎn)受體（PD-1、TIM-3、LAG-3、TIGIT）。它們當(dāng)中大部分的配體，是MHC-I，而廣泛表達(dá)的MHC-I配體介導(dǎo)的抑制信號(hào)，對(duì)于NK細(xì)胞響應(yīng)調(diào)節(jié)至關(guān)重要。這些抑制型受體的表達(dá)，因NK細(xì)胞亞群不同而不同，比如CD56bright的NK細(xì)胞都表達(dá)NKG2A/CD94，而不表達(dá)KIRs，但是CD56dim的細(xì)胞只有約50~60%表達(dá)NKG2A/CD94，70~75%表達(dá)KIRs。

                                                    圖3 NK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞間的激活或抑制型受體-配體相互作用

 NK細(xì)胞的響應(yīng)被這些激活或抑制型的相互作用的平衡微妙地調(diào)節(jié)，而這些NK細(xì)胞受體的表達(dá)取決于NK細(xì)胞的亞群，以及腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子或可溶性配體。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞表達(dá)對(duì)應(yīng)的配體，也依賴(lài)于腫瘤類(lèi)型和微環(huán)境。

腫瘤細(xì)胞分裂期間，一定程度地引起DNA損傷，這會(huì)誘導(dǎo)NKG2D和DNAM-1的表達(dá)，進(jìn)而引發(fā)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。然而，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)上調(diào)非經(jīng)典的MHC-I，即HLA-G的表達(dá)，結(jié)合NK細(xì)胞的抑制型受體LIR-1，規(guī)避NK細(xì)胞的識(shí)別和殺傷。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞也可以通過(guò)可溶性的NKG2D的配體，規(guī)避殺傷。這些配體通過(guò)可變剪切的方式，從腫瘤細(xì)胞表面脫落。于是NK細(xì)胞難以通過(guò)激活型受體NKG2D與其配體結(jié)合，也就難以激活對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。同時(shí)，這些可溶性的NKG2D配體，可以結(jié)合遠(yuǎn)處近處的NK細(xì)胞的NKG2D激活型受體，使其處于持續(xù)激活狀態(tài)，而降低了NK細(xì)胞識(shí)別的敏感性。

一些位于腫瘤微環(huán)境中的抑制型免疫細(xì)胞，比如骨髓衍生抑制細(xì)胞（MDSCs）、調(diào)節(jié)型T細(xì)胞（Treg）可以抑制NK細(xì)胞的抗腫瘤活性。MDSCs通過(guò)分泌抑制型細(xì)胞因子IL-10和TGF-β，其中TGF-β可以下調(diào)NK細(xì)胞表面NKG2D的表達(dá)，或者通過(guò)細(xì)胞接觸的方式，抑制NK細(xì)胞的活性。同樣的，Treg也可以通過(guò)膜表面的TGF-β抑制NK細(xì)胞的活性，且Treg也通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性消耗IL-2以減少I(mǎi)L-2對(duì)NK細(xì)胞的激活。

關(guān)于NK細(xì)胞的免疫檢查點(diǎn)，同樣存在著可能的負(fù)調(diào)控機(jī)制（圖3展示了一部分）：

PD-1，在B細(xì)胞和T細(xì)胞表面存在誘導(dǎo)性表達(dá)，同樣的，在NK細(xì)胞表面也有表達(dá)，盡管表達(dá)特性并不清楚，但PD-1減弱免疫功能的機(jī)制是明確的。不過(guò)，當(dāng)NK細(xì)胞提升對(duì)腫瘤細(xì)胞的響應(yīng)時(shí)，特別是IFN-γ分泌時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞PD-1配體的上調(diào)表達(dá)，從而反饋抑制NK細(xì)胞的響應(yīng)。

CTLA-4，在激活的鼠源NK細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)存在表達(dá)。但目前幾乎沒(méi)有線(xiàn)索能直接說(shuō)明，人源NK細(xì)胞表達(dá)CTLA-4的相關(guān)活性。

TIGIT，帶有Ig和ITIM（細(xì)胞內(nèi)基于酪氨酸的抑制模體）結(jié)構(gòu)域的T細(xì)胞免疫受體，通常在NK細(xì)胞上有所表達(dá)，屬于抑制型受體，與DNAM-1共享PVR和Nectin-2受體。許多腫瘤過(guò)表達(dá)TIGIT的配體，CD155，這與腫瘤的增殖和遷移有關(guān)。在腫瘤環(huán)境中，CD8+T細(xì)胞和Treg都會(huì)上調(diào)表達(dá)TIGIT，而阻斷TIGIT能夠增強(qiáng)T細(xì)胞的功能。類(lèi)似的，阻斷TIGIT能夠增強(qiáng)NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性的能力。有數(shù)據(jù)表明，MDSC通過(guò)TIGIT信號(hào)通路，抑制NK細(xì)胞的活性。

KIR，殺手細(xì)胞免疫球類(lèi)似受體，有抑制型和激活型兩種，針對(duì)抑制型的KIR的阻斷，是免疫治療的主攻方向。抑制型KIR有兩類(lèi)，表達(dá)2個(gè)胞外免疫球類(lèi)似結(jié)構(gòu)域（KIR2DL），或者表達(dá)3個(gè)免疫球類(lèi)似結(jié)構(gòu)域（KIR3DL）。兩類(lèi)KIR的信號(hào)通路都通過(guò)ITIM（細(xì)胞內(nèi)基于酪氨酸的抑制模體）實(shí)現(xiàn)。KIR能夠識(shí)別并結(jié)合MHC-I，以抑制NK細(xì)胞的活性。在NK細(xì)胞的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)階段，KIR與自身的MHC-I的相互作用，對(duì)于NK細(xì)胞“教育”的動(dòng)態(tài)過(guò)程非常關(guān)鍵。盡管在腫瘤環(huán)境中，NK細(xì)胞上調(diào)表達(dá)激活型受體，但許多腫瘤能夠保留它們的MHC-I，從而能夠限制KIR表達(dá)NK細(xì)胞的響應(yīng)和殺傷能力。而KIR信號(hào)通路的阻斷型抗體，能夠起到一定的腫瘤治療的效果（圖4）。

KIR抗體，IPH2101，在針對(duì)那些完全緩解狀態(tài)的急性髓細(xì)胞樣白血病患者的I期臨床研究中，顯示KIR結(jié)合發(fā)生在90%以上的NK細(xì)胞中（2周，最小劑量1mg/kg體重）。KIR抗體的治療也升高了TNF-α和MIP-1β的血清濃度，以及NK細(xì)胞早期的激活標(biāo)簽CD69。在多發(fā)性骨髓瘤的治療中，KIR抗體也產(chǎn)生了類(lèi)似的效果。然而，在關(guān)于郁積性多發(fā)性骨髓瘤（MM）的II期臨床中，并沒(méi)有顯著療效。這可能與IPH2101介導(dǎo)的KIR2D受體的胞啃作用有關(guān)，即通過(guò)KIR抗體的ADCC作用，KIR2D受體被“啃掉”并轉(zhuǎn)移到其他免疫細(xì)胞。盡管KIR抗體有效地阻斷了KIR2D的信號(hào)通路，但是也阻斷了這些表達(dá)KIR2D的NK細(xì)胞被“教育”（結(jié)合MHC-I）的能力，最終可能導(dǎo)致NK細(xì)胞對(duì)MM細(xì)胞的響應(yīng)清零。這個(gè)難題也揭示了，在復(fù)雜的生物系統(tǒng)中，靶向檢查點(diǎn)抑制研發(fā)所存在的一些挑戰(zhàn)。

                                        圖4 NK細(xì)胞相關(guān)免疫檢查點(diǎn)的抗體，以及它們的臨床研究進(jìn)展（截至2017年）

C型凝集素異二聚體NKG2A/CD94，在NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞上都有表達(dá)。它屬于抑制型受體，對(duì)應(yīng)的配體是HLA-E，可強(qiáng)烈抑制血液循環(huán)中的NK細(xì)胞。在很多腫瘤類(lèi)型比如實(shí)體瘤或血癌中，上調(diào)編導(dǎo)HLA-E，從而減弱表達(dá)NKG2A的NK細(xì)胞的響應(yīng)。在異源和自體造血干細(xì)胞移植中，NKG2A廣泛表達(dá)于新生的NK細(xì)胞上，它與HLA-E的相互作用成為移植性治療后NK細(xì)胞活性的主要抑制因素。在這個(gè)條件下，NK細(xì)胞通過(guò)減少NKG2A的表達(dá)，恢復(fù)NK細(xì)胞功能，并最終成熟。但在NK細(xì)胞完全成熟之前，阻斷NKG2A也可以恢復(fù)功能，因此NKG2A的功能抑制型抗體也有希望用于治療腫瘤。

Tim-3，T細(xì)胞免疫球和黏液素結(jié)構(gòu)域包含分子，是T細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫響應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子。小鼠中抗Tim-3的作用，導(dǎo)致自發(fā)性的自身免疫作用。在晚期胃癌和肺腺癌患者的外周NK細(xì)胞中，Tim-3上調(diào)表達(dá)。同時(shí)，在75%的胃腸道間質(zhì)瘤患者中，腫瘤濾過(guò)性的NK細(xì)胞上有表達(dá)Tim-3。NK細(xì)胞表達(dá)的Tim-3的具體功能并不明確。源自晚期黑色素瘤的患者的功能受限的NK細(xì)胞，通過(guò)Tim-3拮抗劑的治療，功能可獲得恢復(fù)。然而，阻斷Tim-3和它的配體galectin-9的相互作用，減少了健康NK細(xì)胞對(duì)急性髓性白血?。ˋML）的IFN-γ的產(chǎn)生。在對(duì)PD-1的阻斷有抗性的患者中，Tim-3發(fā)生了阻斷，同時(shí)Tim-3表達(dá)被上調(diào)，因此Tim-3被認(rèn)為存在抑制免疫活性的作用。

Lag-3，淋巴細(xì)胞激活基因3，表達(dá)在CD4+和CD8+T細(xì)胞上。因只有小部分NK細(xì)胞表達(dá)Lag-3，并且NK細(xì)胞與MHC-II并不相互作用，因此Lag-3的功能還不是很清楚。

                                                                      圖5 IL-2/IL-2Rα和IL-15/IL-15Rα的結(jié)構(gòu)示意圖

IL-2和IL-15共享受體的兩個(gè)亞基，即IL-2Rβγ和IL-15Rβγ完全相同，雙亞基復(fù)合體以中親和力受體存在，而結(jié)合了IL-2Rα或IL-15Rα的三亞基復(fù)合體，則以高親和力受體存在。NK細(xì)胞表達(dá)中等親和力的IL-2和IL-15受體。通常情況下，IL-2通過(guò)順式作用，即先于同一細(xì)胞的IL-2Rα結(jié)合，然后與βγ結(jié)合，但NK細(xì)胞沒(méi)有表達(dá)IL-2Rα，需要較高濃度的IL-2才能激活。而IL-15通過(guò)反式作用，即先于另一細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、DC細(xì)胞）的IL-15Rα結(jié)合，然后與βγ結(jié)合。

NK細(xì)胞可以通過(guò)兩種方式克服抑制，一是激活型細(xì)胞因子，比如IL-2、IL-15，二是CD16（FcγRIII）介導(dǎo)的NK細(xì)胞激活。IL-2和IL-15共享相同的βγ-受體亞基，而各自的α受體亞基可以提高它們?cè)谑荏w上的親和力，它們結(jié)合對(duì)應(yīng)的高親和或中親和受體，激活JAK-STAT信號(hào)通路，最終誘導(dǎo)更多的細(xì)胞因子的表達(dá)，細(xì)胞毒性的效應(yīng)功能，以及增殖和存活。

IL-2治療已經(jīng)被大量研究，但是單獨(dú)使用IL-2所產(chǎn)生的療效并不顯著。IL-2的一項(xiàng)缺點(diǎn)是，盡管它能夠激活NK細(xì)胞，但同時(shí)，它也可以增強(qiáng)Treg的活性，限制NK細(xì)胞的響應(yīng)。高劑量IL-2治療腎癌或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，只能讓小部分患者的病情緩和，并且殘留有大量細(xì)胞毒性。因?yàn)榈蛣┝康腎L-2更利于激活Treg的功能，所以IL-2治療受限，而IL-15對(duì)于NK細(xì)胞依然有較好的刺激效果，且不會(huì)激活Treg的功能。

IL-15被用于實(shí)體瘤的治療，以及在白血病患者中，維持NK細(xì)胞數(shù)量和活性。臨床前、非人類(lèi)哺乳動(dòng)物以及早期臨床的數(shù)據(jù)都表明，IL-15可以誘導(dǎo)NK細(xì)胞數(shù)量上升。其中IL-15與IL-15Rα的反式呈遞，對(duì)最大化IL-15功效是必要的。ALT-803（IL-15N72D/IL-15Rα-Fc超級(jí)激動(dòng)劑），在最近針對(duì)卵巢癌的鼠模型研究中，使NK細(xì)胞非常顯著地去顆?；?，并導(dǎo)致細(xì)胞因子的大量產(chǎn)生。如ALT803能夠使卵巢癌患者腹水中的NK細(xì)胞恢復(fù)活性。同時(shí)，在抗CD20抗體的聯(lián)合作用下，ALT803增強(qiáng)了CD16引發(fā)NK細(xì)胞對(duì)B淋巴細(xì)胞的清除。IL-15一方面能夠協(xié)助越過(guò)免疫檢查點(diǎn)的抑制機(jī)制，另一方面能夠完善NK細(xì)胞上CD16介導(dǎo)的功能，因此它成為了新的熱門(mén)免疫治療靶點(diǎn)。

CD16a，即FcγRIIIa，NK細(xì)胞表達(dá)的Fc低親和受體，介導(dǎo)抗體的直接殺傷ADCC。CD16a表達(dá)在CD56dim的NK細(xì)胞上，這些NK細(xì)胞在健康個(gè)體內(nèi)，占有至少80%的所有外周的NK細(xì)胞。CD16a與Fc結(jié)合后，通過(guò)ITAM信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)胞的去顆?；ＥcNK細(xì)胞的其他激活型受體不同，CD16a與Fc的結(jié)合不需要協(xié)同激活，就可以產(chǎn)生強(qiáng)力的響應(yīng)，這也使得NK細(xì)胞能夠在病毒感染和腫瘤形成早期，通過(guò)抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。然而，NK細(xì)胞表達(dá)的CD16a對(duì)不同抗體的Fc親和力有所差異，介導(dǎo)的ADCC的效果參差不齊。因此，開(kāi)發(fā)BiKE和TriKE之類(lèi)的分子，能改進(jìn)親和力，并且可以針對(duì)不同的腫瘤相關(guān)抗原。

                                                                                        圖6 BiTE和BiKE

BiTE能夠同時(shí)結(jié)合T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，具有兩條scFv串聯(lián)結(jié)構(gòu)的抗體，分別結(jié)合T細(xì)胞的CD3ε（TCR亞基）和腫瘤細(xì)胞的腫瘤相關(guān)抗原。而B(niǎo)iKE則能夠同時(shí)結(jié)合NK細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，結(jié)構(gòu)與BiTE相近，結(jié)合NK細(xì)胞的CD16a，強(qiáng)化ADCC作用，以及腫瘤相關(guān)抗原。新一代的BiTE甚至加入了抗PD-1/PD-L1的scFv，以減少免疫檢查點(diǎn)抑制。類(lèi)似的原理（圖3），BiKE可以融合IL-15或拮抗前述受體信號(hào)通路的scFv（TriKE），移除免疫抑制或增強(qiáng)免疫響應(yīng)。

激活NK細(xì)胞、解除NK細(xì)胞的免疫抑制、限制NK細(xì)胞毒性的時(shí)空。

新的針對(duì)NK細(xì)胞的研究，比如仿照BiTE思路而來(lái)的BiKE（圖6），以及仿照CAR-T思路的CAR-NK（另文描述）。BiTE加上抗PD-1的部分成為了CiTE（檢查點(diǎn)抑制T細(xì)胞連接抗體），那么BiKE加上了IL-15的部分而成為了TriKE（三功能NK細(xì)胞連接抗體，圖7，8）：

                                                                                    圖7 CiTE和TriKE

                                                                              圖8 TriKE的臨床研究正在招募中

如果說(shuō)，TriKE給我們提供了增強(qiáng)NK細(xì)胞的免疫響應(yīng)和特異性的參考，那么如何武裝NK細(xì)胞，是可以關(guān)注的點(diǎn)。一方面，抑制NK細(xì)胞的抑制性信號(hào)通路，比如抗體阻斷NK細(xì)胞表面的抑制型受體，或者激活NK細(xì)胞，通過(guò)結(jié)合激活型受體的配體，比如IL-2、IL-15、Fc等；另一方面，提高NK細(xì)胞，尤其是滲透到腫瘤組織的NK細(xì)胞的有效性，提高針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性，比如利用抗腫瘤的單抗。那又如何將這幾方面的優(yōu)勢(shì)綜合起來(lái)“武裝”NK細(xì)胞？

細(xì)胞因子對(duì)腫瘤的治療效果，因?yàn)槭艿剿幬飩鬟f的限制，無(wú)法在腫瘤病灶部位產(chǎn)生足夠的活性，比如之前提到過(guò)IL-2的局限性。為了最大化細(xì)胞因子的治療效果，重組的抗體-細(xì)胞因子融合蛋白被廣泛研究，以增強(qiáng)單抗靶向腫瘤的能力。如此，細(xì)胞因子通過(guò)單抗，被引導(dǎo)至特異性的腫瘤部位，能夠刺激引發(fā)更多有效的抗腫瘤響應(yīng)，并且避免單獨(dú)使用細(xì)胞因子時(shí)會(huì)造成的系統(tǒng)性的細(xì)胞毒性。

                                                        圖9 用于免疫治療的細(xì)胞因子，其中一些還處于臨床研究階段

細(xì)胞因子是多肽或蛋白質(zhì)，在重組基因表達(dá)上，容易實(shí)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)，只需將INFs、ILs之類(lèi)的融合在抗體的N端或C端。比如羅氏在研的RG7813（圖10），包含抗CEA單抗，且其中一條重鏈的C端融合改造后的IL-2。同樣的，前文提到的TriKE，基于scFv抗體，以拉近NK細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，并通過(guò)融合細(xì)胞因子激活NK細(xì)胞的活性。

                                                                                          圖10 RG7813示意圖

抗CEA單抗特異性結(jié)合CEA最靠近細(xì)胞膜表面的結(jié)構(gòu)域，而不結(jié)合因酶切作用而進(jìn)入血液的可溶性部分，sCEA屬于腫瘤細(xì)胞抑制體液免疫的作用。IL-2通過(guò)突變改造，偏向于結(jié)合IL-2中等親和力受體IL-2Rβγ，從而激活NK細(xì)胞或CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞。因?yàn)镮L-2存在，F(xiàn)c的ADCC/CDC的活性被取消，為了長(zhǎng)效作用仍保持FcRn的結(jié)合，并且因?yàn)閱蝹?cè)結(jié)合IL-2，引入KiH技術(shù)實(shí)現(xiàn)Fc的異二聚化。

設(shè)計(jì)理想中的抗體-細(xì)胞因子融合蛋白，包括以下步驟：

選擇合適的靶向抗原：在正常組織中表達(dá)量極低的腫瘤相關(guān)抗原，以減少抗體“沉沒(méi)”在正常組織中而無(wú)法發(fā)揮藥效，同時(shí)也需要腫瘤組織中盡可能高表達(dá)，以便富集足夠多的細(xì)胞因子。細(xì)胞表面的抗原，結(jié)合后不會(huì)被細(xì)胞吸收，這樣可以延長(zhǎng)融合細(xì)胞因子的半衰期。腫瘤微環(huán)境相關(guān)抗原也可以，比如與腫瘤遷移、浸潤(rùn)相關(guān)的細(xì)胞因子。在血液循環(huán)中沒(méi)有顯著的數(shù)量，比如sCEA，能夠持續(xù)性消耗激活的免疫細(xì)胞，使這些免疫細(xì)胞無(wú)法造成有效殺傷。

選擇合適的細(xì)胞因子：考慮細(xì)胞因子靶向到腫瘤細(xì)胞的目的，還沒(méi)有一種單一的細(xì)胞因子具有所有的抗腫瘤的特性。是為了激活和輔助增殖T細(xì)胞、NK細(xì)胞還是巨噬細(xì)胞？是否需要直接作用于腫瘤細(xì)胞，還是用于抑制腫瘤組織血管的形成？細(xì)胞因子介導(dǎo)的殺傷機(jī)制，誘導(dǎo)T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，還是ADCC，還是直接作用？本文優(yōu)先考慮對(duì)NK細(xì)胞的激活作用。

結(jié)構(gòu)的選擇：完整的抗體結(jié)構(gòu)，scFv，F(xiàn)ab等等。

融合細(xì)胞因子的生物活性：通過(guò)定量比較，維持完全的親和力和生物活性，或者減弱活性以減少脫靶造成的系統(tǒng)性細(xì)胞毒性。正常組織中，過(guò)高的親和力可能導(dǎo)致細(xì)胞毒性。而結(jié)合到靶細(xì)胞后，也要注意抗體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬，除非細(xì)胞因子靶向作用于巨噬細(xì)胞。這會(huì)使融合的細(xì)胞因子被巨噬細(xì)胞吞噬和消除。因此，如果用到了Fc融合，F(xiàn)c往往需要通過(guò)改造以減少細(xì)胞因子的非特異消耗。

PK和PD：足夠長(zhǎng)的半衰期，以便于在腫瘤部位富集。

臨床前藥效估計(jì)：在腫瘤模型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)抗腫瘤藥效和免疫毒性。

劑量和使用規(guī)劃：在腫瘤微環(huán)境以及宿主的免疫效應(yīng)細(xì)胞的條件下，基于耐受性和藥代的效果制定。

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9. ESMO HANDBOOK OF IMMUNO-ONCOLOGY. Edited by John B.A.G. (2018) Haanen,Raffaele Califano, Iwona Lugowska, Marina Chiara Garassino.

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