細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法替代生物材料和醫(yī)療器械熱原檢查的近況
陳丹丹 黃清泉 王春仁 奚廷斐 來源：實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)與管理 廈門鱟試劑廠錄入
中國藥品生物制品檢定所 北京 100050
關(guān)鍵詞:細(xì)菌內(nèi)毒素；熱原檢查；生物材料；醫(yī)療器械
1 概述
生物材料和醫(yī)療器械是指用于診斷和治療的介入和植入人體的材料和器械。生物材料和醫(yī)療器械是近30年來發(fā)展起來的新興學(xué)科，目前己經(jīng)在臨床廣泛應(yīng)用。如何保證生物材料和醫(yī)療器械的安全性問題越來越受到各國政府和學(xué)術(shù)界的重視。在生物材料和醫(yī)療器械的安全性評價(jià)中，熱原檢查無疑是重要的內(nèi)容之一。
1942年熱原檢查法首次收載于美國藥典12版(USP XⅡ)。隨后世界各國藥典相繼收載了這一方法，半個(gè)多世紀(jì)以來該方法一直作為法定的熱原檢查法為各國藥典所采用。
各國藥典收載的熱原檢查方法基木相同。該法是將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)，觀察家兔體溫升高的情況，以判斷供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定的一種方法。直至目前，各國藥典確認(rèn)的熱原檢查法仍系沿用60年前建立起來的家兔升溫試驗(yàn)。
由于家兔法本身存在的局限性，人們一直試圖尋找一些新的方法替代或補(bǔ)充。因?yàn)榧彝梅m然能直觀地反映各種熱原的致熱程度，但不易標(biāo)準(zhǔn)化、不能定量、重現(xiàn)性差、靈敏度不如鱟試驗(yàn)高、受某些藥品木身的藥理活性及理化性質(zhì)的影響較大、費(fèi)用高、費(fèi)時(shí)、結(jié)果與家兔的品系和飼養(yǎng)條件有關(guān)、涉及使用動物等。目前己經(jīng)成熟的熱原檢查的替代方法是細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。
細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法(Bacterial Endotoxins Test, BET)自1968年由美國學(xué)者Bang和Levin正式建立(該法又稱作鱟試驗(yàn)，即Limulus Test)至今，經(jīng)過二十多年的不斷完善和發(fā)展，現(xiàn)巳在醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)等方面發(fā)揮著極其重要的作用。
細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法在藥品檢驗(yàn)中的應(yīng)用是從放射性藥品和注射用水開始的。1980年USP20版首次收載細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，1983年UPS20第四增補(bǔ)本規(guī)定5種水和40種放射性藥品采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法代替熱原檢查法。1991年，U SP22版第五增補(bǔ)木又規(guī)定185種藥品采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法代替熱原檢查法。1995年，UPS23規(guī)定471種藥品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，保留熱原檢查的品種不足40種。美國藥典24版共收載579種藥品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。
對于那些直接或間接與心血管系統(tǒng)或軟體組織接觸的標(biāo)有無熱原字樣的生物材料和醫(yī)療器械來說，進(jìn)行熱原檢查是必須的。美國藥典中收載的進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的品種如下:液體給藥設(shè)備，延伸設(shè)備，傳輸設(shè)備，血液給藥設(shè)備，靜脈內(nèi)導(dǎo)管，植入的體外氧氣導(dǎo)管和附件，透析器，透析管和附件，血管移植物，心瓣膜，肌肉內(nèi)藥物傳送管和輸液(血)器等。（廈門鱟試劑廠錄入）
www.houshiji.com
2 現(xiàn)在已經(jīng)采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法替代熱原檢查法的品種
我們統(tǒng)計(jì)了我們工作中己經(jīng)采用內(nèi)毒素檢查法的品種共有35種，具體如下，這是一個(gè)不完全的統(tǒng)計(jì)，因?yàn)檫€有其它我們沒有涉及的品種。
它們是:眼科用粘彈劑、人工晶體、下腔靜脈濾器、必施無菌灌注液、疝修補(bǔ)網(wǎng)織片、體內(nèi)埋植泵、冠脈支架系統(tǒng)、一次性使用無菌穿刺針、膽道球囊導(dǎo)管、一次性血液管理套件、眼科用重水、硅油、腎動脈支架、膜式氧合器、一次性輸液器、一次性注射器、JRS系列自彈式血管內(nèi)支架及輸送系統(tǒng)、JRZ系列不銹鋼z型支架及輸送系統(tǒng)、JRN系列鎳欽形狀記憶合金支架及輸送系統(tǒng)、CLIN1 MACS管道系統(tǒng)、巴德LU MINEXX支架放置系統(tǒng)、眼內(nèi)灌注用平衡鹽溶液,CLINIMACS CD34細(xì)胞分選試劑、頸動脈轉(zhuǎn)流管、靜脈導(dǎo)管套件盒及附件、眼用透明質(zhì)酸鈉、海藻酸鈉微球血管栓塞劑一次性使用麻醉穿刺包、張力環(huán)、青光眼引流器、輸精管濾過裝置、外科種植體、組織固定系統(tǒng)、血管移植物、生物陶瓷義眼臺、器官保存液等。（廈門鱟試劑廠www.houshiji.com錄入）
3 仍然采用熱原檢查法的品種（廈門鱟試劑廠www.houshiji.com錄入）
根據(jù)我們工作中的品種進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，仍有18種采用熱原檢查法，即家兔法。它們是:止血膠原海綿、醫(yī)用即溶止血紗布、一次性活檢裝置、一次性使用輸血泵、心臟瓣膜、尼龍眼科帶針縫合線、一次性使用中心靜脈導(dǎo)管，PGA可吸收縫合線、人工骨粒、生物衍生骨、外科修補(bǔ)材料、水凝膠乳房植入體、一次性使用創(chuàng)傷手術(shù)縫合包、鹽水乳房假體、硅凝膠乳房假體、可吸收椎間融合器、聚丙烯粒料、離心泵泵頭等。（廈門鱟試劑廠www.houshiji.com錄入）
4 采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法替代家兔法的優(yōu)缺點(diǎn)（廈門鱟試劑廠www.houshiji.com錄入）
優(yōu)點(diǎn):方便、快捷、經(jīng)濟(jì):缺點(diǎn):干擾作用、回收率低。
5 應(yīng)用
生物材料和醫(yī)療器械的熱原檢查用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法來替代是大勢所趨，相信隨著細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的廣泛應(yīng)用，越來越多品種的熱原檢查將會被鱟試驗(yàn)法所取代。同時(shí)這也是動物保護(hù)的一個(gè)重要內(nèi)容。自1959年W. M. S.Russell(動物學(xué)家)和 R. L. Burch(微安全性家)發(fā)表《仁慈試驗(yàn)技術(shù)原理》(The Principles of Humane Experirrrental Technique) 一書以來，以減少(Reduction)、優(yōu)化(Refinement) 和替代(Replacement)為核心的動物試驗(yàn)替代方法的3R理論己經(jīng)被愈來愈多的的科學(xué)家所接受，并在實(shí)際研究工作中得到了廣泛的應(yīng)用，對推動生命科學(xué)以及相關(guān)學(xué)科研究的發(fā)展起到了重要作用。到目前為止，一個(gè)定期連續(xù)召開的世界性學(xué)術(shù)會議--動物試驗(yàn)替代方法世界大會己經(jīng)召開了二次:1993年在美國的巴爾的摩( Baltimore) , 1996年在荷蘭的烏特勒支(Utrecht) , 1999年在意大利的波倫那(Bologna) 。第四次于2002年8月在美國的新奧爾良(New Orleans)召開.
此外，除了用細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)替代熱原試驗(yàn)外，目前很多學(xué)者正在研究用人的血液THP-1和MM6細(xì)胞系檢測熱原。（廈門鱟試劑廠www.houshiji.com錄入）
目前存在的問題是標(biāo)準(zhǔn)、方法不規(guī)范和統(tǒng)一。（廈門鱟試劑廠www.houshiji.com錄入）
發(fā)布時(shí)間：2008-12-30
醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法 （內(nèi)毒素部分）GBT14233.2-2005
GBT14233.2-2005-醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法 第二部分：生物試驗(yàn)方法（內(nèi)毒素部分）
GB/T 14233.2-2005
4 細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)
4.1 目的
本試驗(yàn)為《中國藥典（二部）》附錄“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”中規(guī)定的“凝膠法”，系利用鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的機(jī)理，以判定供試品中內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定。
如經(jīng)檢驗(yàn)證實(shí)供試品對細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)有不能排除的干擾作用則不適宜采用本試驗(yàn)。
4.2 試劑
細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品、細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品、鱟試劑、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。
注：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水系指符合《中國藥典（二部）》附錄中“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”規(guī)定的滅菌注射用水。
4.3 主要設(shè)備
超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、電熱干燥箱、旋渦混合器。
4.4 試驗(yàn)前準(zhǔn)備
4.4.1 器具處理
試驗(yàn)所用器皿需經(jīng)處理除去可能存在的外源性內(nèi)毒素。玻璃器皿置電熱干燥箱內(nèi)180℃干烤至少2h，或250℃干烤至少30min，塑料器皿置30％雙氧水中浸泡4h，再用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水充分沖洗后置60℃烘干備用。
4.4.2 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)
4.4.2.1 當(dāng)使用新批號的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。
4.4.2.2 試驗(yàn)步驟按《中國藥典（二部）》附錄“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”中規(guī)定進(jìn)行。
見http://www.houshiji.com/newslist.asp?newsid=135
4.4.3 供試品干擾試驗(yàn)
4.4.3.1 對未知或可疑的供試品初次進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)之前應(yīng)先進(jìn)行干擾試驗(yàn)，以檢驗(yàn)供試品對細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)是否有抑制或增強(qiáng)作用，以及其他影響細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)準(zhǔn)確性和敏感性的干擾作用。當(dāng)鱟試劑、供試品來源、供試品配方或生產(chǎn)工藝有變化或其他任何可能影響細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)結(jié)果的試驗(yàn)條件改變時(shí)，應(yīng)重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。
4.4.3.2 每種醫(yī)療器械產(chǎn)品應(yīng)取3批并分別使用不少于兩個(gè)制造商生產(chǎn)的鱟試劑進(jìn)行干擾試驗(yàn)。供試液制備按4.5.3規(guī)定進(jìn)行。
4.4.3.3 試驗(yàn)步驟按《中國藥典（二部）》附錄“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”中“凝膠法”規(guī)定進(jìn)行。
4.4.3.4 供試品對細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)有干擾作用，可選用下列適宜方法排除干擾：
a) 使用更靈敏的鱟試劑對供試液進(jìn)行更大倍數(shù)稀釋；
b) 采用無熱原氨基甲烷緩沖液稀釋供試液；
c) 采用無熱原氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)供試液PH值在6.0~8.0范圍內(nèi)；
d) 采用陽離子緩沖液（MgSO4或MgCl2）稀釋供試液以調(diào)節(jié)離子濃度。
4.5 試驗(yàn)方法
4.5.1 供試品數(shù)量
同一批號至少3個(gè)單位供試品。
4.5.2 浸提介質(zhì)
細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水
4.5.3 供試液制備
根據(jù)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的細(xì)菌內(nèi)毒素限值確定浸提介質(zhì)體積，選用下列適宜方法制備供試液：
a) 管類和容器類器具用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水浸泡器具內(nèi)腔，在（37±1）℃恒溫箱中浸提不少于1h；
b) 小型配件或?qū)嶓w類器具置無熱原玻璃器皿內(nèi)，加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水振搖數(shù)次，在
（37±1）℃恒溫箱中浸泡不少于1h。
供試液貯存應(yīng)不超過2 h。
注1：浸提介質(zhì)體積計(jì)算公式：V=L/λ
式中：
V——浸提介質(zhì)體積，單位為毫升（mL）；
L——產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素限值，單位為細(xì)菌內(nèi)毒素單位每件（EU/件）；
λ——所用鱟試劑靈敏度標(biāo)示值，單位為細(xì)菌內(nèi)毒素單位每毫升（EU/mL）。
注2：輸液、輸血、注射器具細(xì)菌內(nèi)毒素限值在產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，宜盡可能低。推薦輸液、輸血、
注射器具細(xì)菌內(nèi)毒素限量每件不超過20EU，與腦脊液接觸和胸內(nèi)應(yīng)用醫(yī)療器械每件不超過2.15EU。
4．5．4 試驗(yàn)步驟和結(jié)果判定
按《中國藥典（二部）》附錄“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”中“凝膠法”規(guī)定進(jìn)行。
4．5．5 試驗(yàn)報(bào)告
試驗(yàn)報(bào)告中宜給出下列信息：
a)供試品名稱；
b)生產(chǎn)批號；
c)供試液制備方法；
d)細(xì)菌內(nèi)毒素限量；
e)結(jié)果判定。
--------節(jié)選自 《GBT14233.2-2005-醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法》
廈門鱟試劑廠www.houshiji.com 整理錄入
2008年11月 |
