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| 購(gòu)買進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 kjhfd.cn |
本法系利用鱟試劑來(lái)檢測(cè)或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查包括兩種方法，即凝膠法和光度測(cè)定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。供試品檢測(cè)時(shí)，可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)測(cè)定結(jié)果有爭(zhēng)議時(shí)，除另有規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)。
細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位（EU）表示。
細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品系自大腸桿菌提取精制而成，用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度和標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)。
細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品系以細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價(jià)，用于試驗(yàn)中鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗(yàn)及設(shè)置的各種陽(yáng)性對(duì)照。
凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水系指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌注射用水。定量測(cè)定用的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，其內(nèi)毒素的含量應(yīng)小于0.005EU/ml。
試驗(yàn)所用的器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。常用的方法是在250℃干烤至少30分鐘，也可用其他確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)明無(wú)內(nèi)毒素并且對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾的器械。試驗(yàn)操作過(guò)程應(yīng)防止微生物的污染。
供試品溶液的制備 某些供試品需進(jìn)行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試品溶液的PH值在6.0-8.0的范圍內(nèi)。對(duì)于過(guò)酸、過(guò)堿或本身有緩沖能力的供試品，需調(diào)節(jié)被測(cè)溶液（或其稀釋液）的PH值，可使用酸、堿溶液或鱟試劑生產(chǎn)廠家推薦的適宜的緩沖劑調(diào)節(jié)PH值。酸或堿溶液須用檢查用水在已去除內(nèi)毒素的容器中進(jìn)行配制。緩沖液必須經(jīng)過(guò)驗(yàn)證不含內(nèi)毒素和干擾因子。
內(nèi)毒素限值的建立 藥品、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）一般按以下公式確定：
L=K/M
式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性單位）表示；
K為人每公斤體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/(kg·h)表示，注射劑K=5E U/(kg·h)，放射性藥品注射劑K=2.5 EU/(kg·h)，鞘內(nèi)用注射劑K=0.2 EU/(kg·h)。
M為人用每公斤體重每小時(shí)最大劑量，以ml(kg·h)、mg (kg·h)或U/ (kg·h)表示，人均體重按60kg計(jì)算，注射時(shí)間若不足1小時(shí)，按1小時(shí)計(jì)算。
按人用劑量計(jì)算限值時(shí)，如遇特殊情況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實(shí)際情況做必要調(diào)整，但需說(shuō)明理由。
確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD） 最大有效稀釋倍數(shù)是指供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過(guò)此稀釋倍數(shù)下可進(jìn)行內(nèi)毒素限值的檢測(cè)。用以下公式來(lái)確定MVD：
MVD=CL/λ
式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值；
C為供試品溶液的濃度，當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，則C等于1.0ml/ml，當(dāng)L以EU/mg或EU/U表示時(shí)，C的單位需為mg/ml或U /ml。如供試品為注射用無(wú)菌粉末或原料藥，則MVD取1，計(jì)算供試品的最小有效濃度C=λ/L。
λ為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度（EU/ml），或是在光度測(cè)定法中所使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低的內(nèi)毒素濃度。
方法1 凝膠法
凝膠法系通過(guò)鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來(lái)檢測(cè)或半定量?jī)?nèi)毒素的方法。在本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，用EU/ml表示。
鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn) 當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。
根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值（λ），將細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30秒鐘。取含有分裝了0.1ml鱟試劑溶液的10mm×75mm試管或復(fù)溶后的0.1ml/支規(guī)格的鱟試劑原安瓿18支，其中16管分別加入0.1ml不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，及每一個(gè)濃度平行做4管；另外2管加入0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì)照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37℃±1℃適宜恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。
將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°時(shí)，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽(yáng)性；形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形或從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過(guò)程應(yīng)避免受到振動(dòng)造成假陰性結(jié)果。
若最大濃度2λ管均為陽(yáng)性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對(duì)照管為陰性，試驗(yàn)方為有效。按下式計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測(cè)定值(λc).
λc=1g-1(∑X/4)
式中X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（1g）。反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果的濃度。
當(dāng)λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。
干擾試驗(yàn) 按表1制備溶液A、B、C和D，使用的供試品溶液應(yīng)為未檢驗(yàn)出內(nèi)毒素且不超過(guò)最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的溶液，按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。
只有當(dāng)溶液A和陰性對(duì)照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果在鱟試劑靈敏度復(fù)核范圍內(nèi)時(shí)，試驗(yàn)方為有效。按下式計(jì)算C和B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Es和Et）。
Es= 1g-1(∑Xs/4)
Et= 1g-1(∑Xt/4)
式中Xs、Xt分別為系列溶液C和溶液B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（1g）。
當(dāng)Es在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es-2Es (包括0.5 Es和2 Es)時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無(wú)干擾作用。若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對(duì)試驗(yàn)有干擾，應(yīng)將供試品溶液進(jìn)行不超過(guò)MVD的進(jìn)一步稀釋，再重復(fù)干擾試驗(yàn)。
表1 凝膠法干擾試驗(yàn)溶液的制備
注：A 供試品溶液；B干擾試驗(yàn)系列；C鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對(duì)照系列；D陰性對(duì)照。
可通過(guò)對(duì)供試品進(jìn)行更大倍數(shù)的稀釋或通過(guò)其他適宜的方法（如過(guò)濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效的排除干擾且不會(huì)使內(nèi)毒素失去活性，要使用預(yù)先添加了標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素再經(jīng)過(guò)處理的供試品溶液進(jìn)行干擾試驗(yàn)。
當(dāng)進(jìn)行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)前，或無(wú)內(nèi)毒素檢查項(xiàng)的品種建立內(nèi)毒素檢查法時(shí)，須進(jìn)行干擾試驗(yàn)。
當(dāng)鱟試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。
檢查法
1）凝膠限量試驗(yàn)
按表2制備溶液A、B、C、D。使用稀釋倍數(shù)為MVD并且已經(jīng)排除干擾的供試品溶液來(lái)制備溶液A和B。按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。
表2 凝膠限量試驗(yàn)溶液的制備
注：A供試品溶液；B供試品陽(yáng)性對(duì)照；C陽(yáng)性對(duì)照；D陰性對(duì)照。
結(jié)果判斷 保溫60分鐘±2分鐘后觀察結(jié)果。若陰性對(duì)照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽(yáng)性對(duì)照B的平行管均為陽(yáng)性，陽(yáng)性對(duì)照溶液C的平行管均為陽(yáng)性，試驗(yàn)有效。
若溶液A的兩個(gè)平行管都為陰性，判供試品符合規(guī)定；若溶液A的兩個(gè)平行管均為陽(yáng)性，判供試品不符合規(guī)定。若溶液A的兩個(gè)平行管中的一管為陽(yáng)性另一管為陰性，需進(jìn)行復(fù)試。復(fù)試時(shí)，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判供試品符合規(guī)定；否則判供試品不符合規(guī)定。
2）凝膠半定量試驗(yàn)
本方法系通過(guò)確定反應(yīng)終點(diǎn)濃度來(lái)量化供試品中內(nèi)毒素的含量。依表3制備溶液A、B、C和D。按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。
結(jié)果判斷 若陰性對(duì)照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽(yáng)性對(duì)照B的平行管均為陽(yáng)性，系列溶液C的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值在0.5λ-2λ之間，試驗(yàn)有效。
系列溶液A中每一系列平行管的終點(diǎn)稀釋倍數(shù)乘以λ，為每個(gè)系列的反應(yīng)終點(diǎn)濃度，所有平行管反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內(nèi)毒素濃度（按公式CE=1g-1(∑X/2)）。如果試驗(yàn)時(shí)采用的是供試品的稀釋液，則計(jì)算原始溶液內(nèi)毒素濃度時(shí)要將結(jié)果乘上稀釋倍數(shù)。
如試驗(yàn)中供試品溶液的結(jié)果都為陰性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度小于λ（如果檢驗(yàn)的是稀釋過(guò)的供試品，則記錄為小于λ乘以該供試品的最低稀釋倍數(shù)）。如果結(jié)果都為陽(yáng)性，應(yīng)記為內(nèi)毒素的濃度大于或等于最大的稀釋倍數(shù)乘以λ。
若內(nèi)毒素濃度小于規(guī)定的限值，判供試品符合規(guī)定。若內(nèi)毒素濃度大于或等于規(guī)定的限值，判供試品不符合規(guī)定。
表3 凝膠半定量試驗(yàn)溶液的制備
注：A：沒(méi)有超過(guò)MVD并且通過(guò)干擾試驗(yàn)的供試品溶液。用檢查用水進(jìn)行2倍系列稀釋，從通過(guò)干擾試驗(yàn)的稀釋倍數(shù)開(kāi)始再稀釋至1倍、2倍、4倍和8倍，但隨后的稀釋也不得超過(guò)MVD；
B：含2λ濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的溶液A（供試品陽(yáng)性對(duì)照）；
C：含2λ、1λ、0.5λ和0.25λ濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的檢查用水系列；
D：陰性對(duì)照。
方法2 光度測(cè)定法
光度測(cè)定法分為濁度法和顯色基質(zhì)法。
濁度法系利用檢測(cè)鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過(guò)程過(guò)程中的濁度變化而測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)檢測(cè)原理，可分為終點(diǎn)濁度法和動(dòng)態(tài)濁度法。終點(diǎn)濁度法是依據(jù)反映混合物中的內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時(shí)的濁度（吸光度和透光率）之間存在著量化關(guān)系來(lái)測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。動(dòng)態(tài)濁度法是檢測(cè)反應(yīng)混合物的濁度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時(shí)間，或是檢測(cè)濁度增加速度的方法。
顯色基質(zhì)法系利用鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物顯色釋放出的呈色團(tuán)的多少而測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)檢測(cè)原理，分為終點(diǎn)顯色法和動(dòng)態(tài)顯色法。終點(diǎn)顯色法是依據(jù)反應(yīng)混合物中內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時(shí)釋放出的有色團(tuán)的量之間存在著量化關(guān)系來(lái)測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。動(dòng)態(tài)顯色法是檢測(cè)反應(yīng)混合物的色度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時(shí)間，或是檢測(cè)色度增長(zhǎng)速度的方法。
光度測(cè)定試驗(yàn)應(yīng)在特定的儀器中進(jìn)行，溫度一般為37℃±1℃。
供試品和鱟試劑的加樣量、供試品和鱟試劑的比例以及保溫時(shí)間等，參照所用儀器和試劑的有關(guān)說(shuō)明進(jìn)行。
為保證濁度和顯色試驗(yàn)的有效性，應(yīng)預(yù)先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)以及供試品溶液的干擾試驗(yàn)。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn) 當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，需進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)。
用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素配成溶液，并制成至少3個(gè)濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不得大于10），最低濃度不得低于所用鱟試劑的標(biāo)示檢測(cè)限。每一稀釋步驟的混勻時(shí)間同凝膠法，每一濃度至少做3支平行管。同時(shí)要求做2支陰性對(duì)照。當(dāng)陰性對(duì)照在設(shè)定的時(shí)間內(nèi)不發(fā)生反應(yīng)，將全部數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析。
根據(jù)線性回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（r）的絕對(duì)值應(yīng)該大于或等于0.980，試驗(yàn)方為有效。否則須重新試驗(yàn)。
干擾試驗(yàn) 選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或一個(gè)靠近中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度。按表4制備溶液A、B、C和D。每種溶液至少做2個(gè)平行管。
表4 光度測(cè)定法干擾試驗(yàn)的制備
注 A：稀釋倍數(shù)未超過(guò)MVD的供試品溶液。
B：加入標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或靠近中點(diǎn)的一個(gè)已知內(nèi)毒素濃度的，且與溶液A有相同稀釋倍數(shù)的供試品溶液。
C：如“標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)”項(xiàng)下描述的，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液。
D：陰性對(duì)照。
按所得線性回歸方程分別計(jì)算供試品溶液和含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的供試品溶液的內(nèi)毒素含量Ct和Cs，再按下式計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率（R）。
R=(CS-Ct)/λm×100%
當(dāng)內(nèi)毒素的回收率在50%~200%之間，則認(rèn)為在此該試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。
當(dāng)內(nèi)毒素的回收率不在指定的范圍時(shí)，須按“凝膠法干擾試驗(yàn)”中的方法去除干擾因素。并要重復(fù)干擾試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證處理的有效性。
當(dāng)鱟試劑、供試品的來(lái)源、配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。
檢查法
按“光度法的干擾試驗(yàn)”中的操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。
使用溶液C生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算溶液A的每一平行管的內(nèi)毒素濃度。
試驗(yàn)必須符合以下三個(gè)條件方為有效：
（1）系列溶液C的結(jié)果要符合 “標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)”中的要求。
（2）用溶液B中的內(nèi)毒素濃度減去溶液A中的內(nèi)毒素濃度后，計(jì)算出的內(nèi)毒素的回收率要在50%-200%的范圍內(nèi)。
（3）溶液D在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)不發(fā)生反應(yīng)。
若供試品溶液所在平行管的平均內(nèi)毒素濃度乘以稀釋倍數(shù)和濃度后，小于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判供試品符合規(guī)定。若大于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判供試品不符合規(guī)定。
（注：本檢查法中，“管”的意思包括其他任何反應(yīng)容器，如微孔板中的孔。）
來(lái)源--中華人民共和國(guó)藥典2005年版 附錄Ⅺ E |
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