1 檢測方法
AFT的測定方法有多種，概括起來有化學(xué)分析法、儀器分析法、生物鑒定法及免疫分析法等 ［2］ 。
1.1 生物鑒定法 其特點(diǎn)是待檢樣品不需很純，主要用于定性，共有10種:（1）抑菌試驗(yàn);（2）對(duì)微生物遺傳因子影響試驗(yàn);（3）細(xì)菌發(fā)光試驗(yàn);（4）熒光反應(yīng);（5）組織培養(yǎng)檢測法;（6）雞胚試驗(yàn);（7）鴨胚試驗(yàn);（8）鱒魚試驗(yàn);（9）植物試驗(yàn);（10）飼喂實(shí)驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)。生物鑒定法是利用AFT能影響微生物、水生動(dòng)物、家禽等生物體的細(xì)胞代謝，來鑒定AFT的存在。其方法專一性差，靈敏度低，一般只作為化學(xué)分析法的佐證。
1.2 化學(xué)分析法 最常用的為薄層層析法（TLC），適用于糧食及其制品、調(diào)味品等AFB 1 的檢測，主要是半定量。利用AFB 1 具有熒光性的特點(diǎn)，提取和濃縮樣品中的AFB 1 ，用單向或雙向展開法在薄層上分離后，在365nm紫外光照射下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，根據(jù)在薄層上顯示熒光的最低檢出量定量，其靈敏度為5μg/kg。由于薄層層析法測定AFB 1 不是很專一，因此樣品中其他熒光物質(zhì)的干擾造成測定誤差?？梢杂靡韵路椒ㄟM(jìn)行確定:一是用多種溶劑系統(tǒng)展開，可將AFB 1 、G 1 及各種AFT類似物分開;二是采用層析斑點(diǎn)的化學(xué)試驗(yàn)，將樣品提取物用甲酸亞硫酰氨或三氟醋酸處理，用衍生化的方法將AFB 1 與其類似物分開;三是層析斑點(diǎn)的物理試驗(yàn)，可根據(jù)紫外吸收光譜，紅外吸收光譜和熒光屏光譜的差別，將非黃曲霉毒素和AFT分開。
1.3 儀器分析法 高效液相色譜法（HPLC）是20世紀(jì)70年代初發(fā)展起來的一種以液體為流行相的新型色譜技術(shù)。是分離分析各種AFT的好方法，如配以熒光檢測器，則該法具有靈敏度高、分離能力強(qiáng)、特異性好、測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)。在國外己廣泛地用于食品中AFT的測定。但由于食物樣品成分復(fù)雜，在進(jìn)行液相色譜分離分析前，需對(duì)樣品作徹底有效的凈化處理。常用的凈化方法是柱色譜法，該法操作繁瑣，且需使用大量有機(jī)溶劑。免疫親和柱作為AFT特異有效的分離凈化和濃縮手段，一出現(xiàn)就和高效液相色譜法結(jié)合用來測定糧食、飲料、尿、血及奶中的AFT。王光建等 ［3］ 將免疫親和柱的高度特異性和高效液相色譜法的高分離能力相結(jié)合，所建立的花生和玉米中AFB l 、B 2 、G 1 、G 2 的測定方法，具有雜質(zhì)干擾少、操作簡便、使用有機(jī)溶劑少、靈敏準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，整個(gè)分析操作可在15min內(nèi)完成。
1.4 免疫分析法 這種方法是利用免疫、酶及生化技術(shù)，開辟了AFT分析的新領(lǐng)域。目前應(yīng)用的方法有放射免疫法、親和層析法和酶聯(lián)免疫法。（1）放射免疫法。特異性強(qiáng)、靈敏度高、比較準(zhǔn)確迅速、操作簡單、易于標(biāo)準(zhǔn)化。但也有嚴(yán)重的缺點(diǎn)，特別是需要持殊的設(shè)備和安全保護(hù)，妨礙了更廣泛的應(yīng)用。（2）親和層析法。利用免疫化學(xué)反應(yīng)原理，采用大劑量的單克隆抗體，選擇性吸附提取液中的抗原物質(zhì)-AFT。由于抗原-抗體反應(yīng)具有高靈敏、高選擇、高特異性等特點(diǎn)，從而大大提高了試樣的凈化效果及檢測靈敏度，同時(shí)可顯著減少有毒有害試劑的使用，十分有利于操作人員的健康和環(huán)境保護(hù)。張藝兵等 ［4］ 提出了一種以免疫親和柱凈化結(jié)合熒光光度法檢測AFT的新方法，檢測低限可達(dá)10 -11 ～10 -12 g/ml。20世紀(jì)90年代起，免疫親和技術(shù)在食品分析領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。（3）酶聯(lián)免疫法（ELISA）。基本原理是將抗體吸附于固相載體上，加入已經(jīng)用酶標(biāo)記的抗原與樣品中的待測物混合物進(jìn)行特異性的免疫反應(yīng)，然后再加入酶的底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，通過顏色的深淡來判斷樣品中待測物的（抗原）含量。酶聯(lián)免疫法大體分為兩類:—是用雙抗體夾心法檢測樣本中的AFT。如Wogan將AFB l 牛血清白蛋白涂于微滴定板池，經(jīng)初步培養(yǎng)后，加兔的APTB 1 抗體和游離APTB 1 用磷酸4—硝基苯酯作基質(zhì)。以堿性磷酸酶—抗兔免疫球蛋白檢測第—抗體的結(jié)合;二是用競爭法檢測樣本中的AFT。如在涂抗體的小孔中，用乙烷萃取的AFB l ，并與結(jié)合了辣根過氧化酶的AFTB 1 混合室溫下10min后，用水洗除去未結(jié)合的黃曲霉共軛物，加底物后在405nm檢測。ELISA法靈敏度高，比薄層法提高了近200～500倍 ［1，5］ ，特異性強(qiáng)，熒光物質(zhì)、色素、結(jié)構(gòu)類似物對(duì)結(jié)果無干擾。而且回收率高，準(zhǔn)確性好，提取方法簡單，測定時(shí)間僅需2h，可同時(shí)檢測幾十份樣品，提高了工效。
2 比較與應(yīng)用
2.1 關(guān)于酶聯(lián)免疫法與薄層層析法的比較 AFT的檢測有簡易的方法，但不能定量;也有復(fù)雜的方法、可以定量，但不易推廣。由于高效液相色譜法雖然具有快速、靈敏度高、準(zhǔn)確、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，但因儀器價(jià)格昂貴，難以在基層推廣。故在此僅將最常用的薄層層析法與酶聯(lián)免疫法進(jìn)行一下比較。
薄層層析（TLC）是最初被用于檢測AFB 1 的標(biāo)準(zhǔn)分析方法，在酶聯(lián)免疫吸附法建立之前，國家標(biāo)準(zhǔn)一直采用薄層層析法作為測定AFB 1 的基本方法。TLC測定AFB 1 ，其步驟多，耗費(fèi)大量試劑，干擾因素多，測定一個(gè)樣品要2～3天時(shí)間，靈敏度低，熒光強(qiáng)度的目測精確性較差，僅能半定量且操作人員要直接接觸毒素和接觸大量有潛在危害的有機(jī)溶劑，不適于大批量樣品的快速檢測。從幾十年的實(shí)踐中總結(jié)得出這種方法的主要不足之處是靈敏度不高，特異性不強(qiáng)和安全性能較差。
ELISA法是近年快速發(fā)展起來的一項(xiàng)實(shí)用新技術(shù)，它利用抗原和抗體的免疫反應(yīng)和酶的高效催化作用進(jìn)行定性定量測定，其特異性強(qiáng)，靈敏度高，分析速度快，并可簡化提取和純化等步驟，在微量毒害物質(zhì)的檢測中已得到廣泛應(yīng)用。由于ELISA法中酶的活性較敏感，某些特殊樣品，如葡萄酒類、含鹽量高的醬油、含脂量高的食用油等，在提取時(shí)要進(jìn)行調(diào)pH值、脫鹽、脫脂處理，以免對(duì)酶活的影響，提高測定的準(zhǔn)確性。
酶聯(lián)免疫法對(duì)AFB 1 的最低檢出濃度為0.01μg/kg，比薄層分析法檢測靈敏度高500倍，而且，由于單克隆抗體本身具備的強(qiáng)特異性，定量分析和定性分析等于同時(shí)完成，所對(duì)呈陽性結(jié)果的樣品不必再做確證試驗(yàn)，檢測結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定。其它熒光物質(zhì)、色素、結(jié)構(gòu)類似物對(duì)檢測無干擾，整個(gè)測定過程僅需2h，并且一次可同時(shí)測定幾十份樣品。在樣品提取時(shí)，也因此適當(dāng)簡化了反復(fù)純化、分離的步驟，適合處理批量樣品。此外，用酶免疫法檢測法時(shí)，使用者對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線用數(shù)值插入法計(jì)算結(jié)果，可以避免因接觸標(biāo)準(zhǔn)毒品受到的傷害。ELISA測定AFB l 已于1989年首先在美國公職分析家協(xié)會(huì)獲得通過，被列為國際上公認(rèn)分析方法。
2.2 AFT檢測的應(yīng)用研究 （1）在食品衛(wèi)生檢驗(yàn)中的應(yīng)用。國內(nèi)在20世紀(jì)90年代中期也開展了ELISA檢測AFB 1 的應(yīng)用研究 ［6～8］ ，取得了很好的效果，顯示出了方法簡便易行，耗時(shí)少，特異性強(qiáng)，靈敏度高的特點(diǎn)，對(duì)于大量樣品的篩選檢測尤為適合。路戈等 ［7］ 用單克隆抗體酶聯(lián)免疫測定方法與薄層層析法對(duì)比檢測了糧油樣品，TLC法檢測結(jié)果表明，在方法靈敏度下（5ng/g）所檢樣本中均無AFB 1 檢出。而這些樣品按ELISA法檢測，AFB l 檢出率為96%，含量在0.05～2.20ng/g之間。ELISA法的檢測靈敏度遠(yuǎn)高于TLC法。陳蘭明等 ［8］ 認(rèn)為AFB l間接競爭抑制ELISA（IDC—ELISA）定量分析法傳統(tǒng)TLC法更具有簡便、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，它不僅適用于大批量樣品的快速檢測，而且具有投入商品化生產(chǎn)及“家用化驗(yàn)”發(fā)展的潛力。劉冬兒 ［9］ 用酶聯(lián)免疫吸附分析法測定食品中的AFB l ，線性范圍0.25～5.0ng/ml，檢測靈敏度達(dá)0.015μg/kg，比薄層色譜法提高300～400倍，回收率大于89.2，精密度大于7.67%。整個(gè)測定過程僅為4h，大大縮短了檢測時(shí)間。筆者 ［10］ 也曾采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測啟東地區(qū)106例玉米樣品中的AFT含量，并 與常規(guī)薄層層析法進(jìn)行了比較，結(jié)果證明ELISA法優(yōu)于薄層層析法。ELISA法檢測的含量均高于薄層層析法，且未出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象，顯示ELISA法具有特異性和高靈敏性。該法為食品衛(wèi)生檢驗(yàn)、為肝癌高發(fā)現(xiàn)場糧食中AFT的監(jiān)測及防霉去毒研究等提供了一個(gè)良好的技術(shù)手段，具有較好的應(yīng)用前景。（2）在肝癌病因與預(yù)防中的應(yīng)用。迄今為止，AFT的致肝癌性在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中已沒有人懷疑。但在人類中的研究由于缺乏直接的證據(jù)而尚不能充分肯定，不過人類食物中AFT的普遍污染是人肝癌發(fā)生的可能因素的觀點(diǎn)已得到了廣泛的承認(rèn)。目前認(rèn)為測定AFT白蛋白（AF-Alb）化合物可以作為攝入AFT的體內(nèi)指標(biāo);并經(jīng)全球眾多的研究證實(shí)AF-Alb是一個(gè)用于估計(jì)AFT暴露水平很好的標(biāo)記 ［11］ 。
AFT暴露的生物標(biāo)記是基于對(duì)人類中這些化合物的了解而建立起來的。生物標(biāo)記水平的改變可用來評(píng)價(jià)干預(yù)的有效性。例如，旨在降低AFT攝入的一級(jí)預(yù)防干預(yù)措施應(yīng)當(dāng)能夠?qū)е滤猩飿?biāo)記水平的下降。此外，檢測個(gè)體AFT代謝情況的能力意味著，還能評(píng)價(jià)設(shè)計(jì)用來改變AFT代謝的化學(xué)預(yù)防劑的有效性。Qian等 ［12］ 在上海、Kensler等 ［13］ 在啟東、Wang等 ［14］ 在扶綏進(jìn)行的多項(xiàng)關(guān)于肝癌化學(xué)預(yù)防的實(shí)驗(yàn)，也均借助于免疫吸附柱純化等AFT檢測技術(shù)，并應(yīng)用于受試者尿樣或血樣的分析，來評(píng)價(jià)預(yù)防干預(yù)的效果。
參考文獻(xiàn)
1 陳愛民，徐耀初.黃曲霉毒素致肝癌的分子機(jī)制及其化學(xué)預(yù)防.國外醫(yī)學(xué)·衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)，1998，25（5）:285-288.
2 劉家珍，劉芮，姚軍.黃曲霉毒素B 1 分析方法.職業(yè)與健康，2002，18（3）:39-40.
3 王光建，何才云，魯長豪，等.用免疫親和柱分離、高效液相色譜法測定花生和玉米中黃曲霉毒素的研究.色譜，1995，13（4）:248-246.
4 張藝兵，張鵬，趙衛(wèi)東，等.熒光光度法快速檢測食品中的黃曲霉毒素.檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，1999，9（6）:25-27.
5 路戈，劉春霞.應(yīng)用免疫技術(shù)測定飼料中的黃曲霉毒素B 1 .中國飼料，1996（5）:42-44.
6 季永鏞，林國妹，葉敏，等.單克隆抗體組建黃曲霉毒素酶免疫檢測試劑盒的研究.單克隆抗體通訊，1995，11（2）:46-48.
7 路戈，計(jì)融，劉春霞.食品中黃曲霉毒素B 1 單克隆抗體酶聯(lián)免疫測定方法的建立及初步應(yīng)用.衛(wèi)生研究，1996，25（3）:162-165.
8 陳蘭明，陳永萱.黃曲霉毒素B 1 間接競爭抑制ELISA定量分析法的建立和應(yīng)用.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，21（2）:65-72.
9 劉冬兒.酶聯(lián)免疫吸附分析法測定食品中的黃曲霉毒素B l .包裝與機(jī)械，2002，23（10）:78-80.
10 陸建華，倪正平，黃飛，等.用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測黃曲霉毒素.中國獸醫(yī)科技，1998，28（1）:33-34.
11 Wild CP，Turner PC.Exposure biomarkers in chemoprevention studies of liver cancer.IARC Sci Pub，2001，154:215-222.
12 Qian GS，Ross RK，Yu MC，et al.A follow-up study of urinary mark-ers of aflatoxin exposure and liver cancer risk in Shanghai，People's Republic of China.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，1994，3（1）:3-10.
13 Kensler TW，Gange SJ，Egner PA，et al.Predictive value of molecular dosimetry:individual versus group effects of oltipraz on aflatoxin-al-bumin adducts and risk of liver cancer.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，1997，6（8）:603-610.
14 Wang JS，Huang T，Su J，et al.Hepatocellular carcinoma and aflatoxin exposure in Zhuqing Village，F(xiàn)usui County，People's Republic of Chi-na.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2001，10（2）:143-146.