http://kjhfd.cn/plus/list.php?tid=79
引言 HIV抗體初篩實(shí)驗(yàn)最常見方法是酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），實(shí)驗(yàn)中許多因素使結(jié)果產(chǎn)生不確定性，現(xiàn)作如下探討。
1 一般資料 2001/2007入伍新兵26600名血清標(biāo)本進(jìn)行HIV抗體測(cè)定，常規(guī)抽取靜脈血，低速離心分離血清，在2h內(nèi)嚴(yán)格按照說明書完成測(cè)定。酶標(biāo)儀為DENLEY DRAGON WE Scan MK2型自動(dòng)酶標(biāo)儀，洗板機(jī)為Stat fax-2600型洗板機(jī)，移液器為eppendorf電子可調(diào)移液器，試劑盒由北京金豪制藥有限公司生產(chǎn); 臨界值設(shè)定為cutoff值=0.1+N（ 陰性對(duì)照平均值）。標(biāo)本A值小于cutoff值為陰性，大于或等于cutoff值為陽(yáng)性；陰性對(duì)照A值小于0.02時(shí)，按0.02計(jì)算；陽(yáng)性對(duì)照A值小于0.5，陰性對(duì)照A值大于0.1，實(shí)驗(yàn)不成立。 結(jié)果全部標(biāo)本HIV抗體陰性。標(biāo)本溶血，加樣快慢，孵育顯色時(shí)間，采用單、雙波長(zhǎng)測(cè)定，洗滌液濃度等均對(duì)ELISA測(cè)定HIV抗體有較大影響。
2 討論
2.1 標(biāo)本采集與保存 ①避免溶血：血紅蛋白含有血紅素基團(tuán)，有類似過氧化物作用，以辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的ELISA實(shí)驗(yàn)中，血清標(biāo)本中血紅蛋白與HRP反應(yīng)顯色出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；②冰凍保存血清樣本須避免反復(fù)凍融：反復(fù)凍融標(biāo)本所產(chǎn)生機(jī)械剪切力對(duì)蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，從而產(chǎn)生假陰性結(jié)果［1］；③待血液標(biāo)本完全凝固方可加樣，否則因反應(yīng)孔內(nèi)出現(xiàn)纖維蛋白凝固或殘留紅細(xì)胞出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
2.2 試劑準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)前將試劑從冰箱取出，室溫放置20min以上以與室溫平衡，使反應(yīng)微孔內(nèi)溫度較快達(dá)到37℃，防止弱陽(yáng)性樣本出現(xiàn)假陰性。
2.3 加樣與試劑 垂直加樣（試劑）不可太快，以防止濺出和產(chǎn)生氣泡，若加樣過快，難以保證加樣量的準(zhǔn)確性。非垂直加樣易加在微孔非包被區(qū)，致非特異性吸附。加樣過猛易使樣本（試劑）濺出對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染，產(chǎn)生氣泡使液面差異致酶標(biāo)儀測(cè)定出現(xiàn)誤差。為確保加入試劑的準(zhǔn)確性，應(yīng)使用精密移液器，不可使用滴瓶滴加。
2.4 孵育 孵育是決定ELISA測(cè)定成敗關(guān)鍵環(huán)節(jié)，所需時(shí)間與溫度成反比，最常用的孵育溫度為37℃，30min。①反應(yīng)時(shí)間：通常在加樣（試劑）后，將微孔放入水浴箱時(shí)，孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃需一定時(shí)間，尤其在室溫較低及非水浴狀態(tài)下，升溫時(shí)間會(huì)較長(zhǎng)；如將微孔從放入水浴箱開始計(jì)時(shí)，使實(shí)際水育時(shí)間不夠，導(dǎo)致弱陽(yáng)性標(biāo)本漏檢。為保證設(shè)定溫度下有足夠孵育時(shí)間，可依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室不同環(huán)境溫度下微孔板從室溫至孵育箱后達(dá)設(shè)定溫度需要時(shí)間長(zhǎng)短確定在孵育箱中孵育時(shí)間；②孵育溫度：國(guó)產(chǎn)HIV抗體初篩ELISA試劑一般為37℃，30min；進(jìn)口試劑可有37℃，1h；從抗原抗體反應(yīng)本質(zhì)來說，在較低溫度下，反應(yīng)較長(zhǎng)時(shí)間最佳。在較高反應(yīng)溫度下，由于分子運(yùn)動(dòng)，反應(yīng)時(shí)間縮短，對(duì)強(qiáng)陽(yáng)性樣本測(cè)定無影響，但對(duì)分子含量較少的弱陽(yáng)性樣本則有漏檢可能；③“邊緣效應(yīng)”：產(chǎn)生邊緣效應(yīng)的原因可能與微孔板周孔與中心孔、孔周與孔中心表面熱力學(xué)特征不同有關(guān)，研究證實(shí)熱力學(xué)梯度是造成“邊緣效應(yīng)”的根本原因［2］。建議盡量使用水浴或?qū)⒎磻?yīng)溶液與微孔板先加熱至設(shè)定溫度，即可避免“邊緣效應(yīng)”。
2.5 洗滌 ①固相免疫測(cè)定技術(shù)是一種非均相測(cè)定技術(shù)：需要洗滌將反應(yīng)過程中非特異性吸附成份洗滌，以確認(rèn)抗原抗體特異性結(jié)合；常用HIV抗體ELISA初篩試劑盒均以HRP(HRP)作為標(biāo)記物的洗滌液，一般為含0.005g/L Tween20中性PBS，Tween20濃度不可過高，超過0.02g/L可使包被于固相上的抗原解吸附而影響實(shí)驗(yàn)測(cè)定下限；為防止洗板機(jī)洗滌后有液體殘留，建議洗完后在吸水紙上拍干；②按要求次數(shù)洗滌。洗滌次數(shù)過少會(huì)因酶殘留導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果（花板）［3］，洗滌次數(shù)過多會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。
2.6 顯色 常用HIV抗體ELISA試劑盒多以HRP為標(biāo)記酶，以四甲基鄰苯胺（TMB）為底物。從理論上講，在37℃，30min才可使底物催化完全，在最初10min內(nèi)絕大部分催化反應(yīng)即可完成。雖然試劑盒要求放置10min，為使弱陽(yáng)性樣本有充分顯色，建議在37℃反應(yīng)20-30min后終止反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定為好。
2.7 雙波長(zhǎng)測(cè)定 ELISA測(cè)定中空白孔非特異性吸附具有不確定性，故測(cè)定時(shí)最好使用雙波長(zhǎng)。
2.8 空白設(shè)定 一般試劑盒均要求設(shè)空白，但我們?cè)趯?shí)際操作中發(fā)現(xiàn)，如使用雙波長(zhǎng)測(cè)定無需設(shè)空白，在使用單波長(zhǎng)測(cè)定時(shí)可設(shè)空白，并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如使用雙波長(zhǎng)測(cè)定并設(shè)空白可能會(huì)造成陰性孔吸光度值為負(fù)數(shù)現(xiàn)象，使結(jié)果判讀難以解釋。
【參考文獻(xiàn)】
［1］赫啟昌，賀霞，杜曉靜，等。HIV抗體檢測(cè)弱陽(yáng)性結(jié)果分析［J］。中國(guó)公共衛(wèi)生，2006，6：696。
［2］季陽(yáng)，賈桂芹，張永剛。HIV抗體篩查與確證［J］。中國(guó)輸血雜志，1994，4：179-181。
［3］于振喜，李連潔。用HIV法檢測(cè)HIV抗體時(shí)如何避免“花板”？［J］。中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2006，23：56。
Editor:李軍民等
