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| 購(gòu)買進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 kjhfd.cn |
一、培養(yǎng)基的歷史 二、細(xì)胞培養(yǎng)目的與用途
1． 科學(xué)研究 （1）藥物研究開發(fā)，如新藥篩選，疫苗、基因工程藥物、細(xì)胞工程藥物 研究與開發(fā)、單克隆抗體制備等。 （2）基礎(chǔ)研究，如藥物作用機(jī)理、基因功能、疾病發(fā)生機(jī)理等研究。 2． 生物制藥 （1）疫苗生產(chǎn)：如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等)，多肽疫 苗（腫瘤疫苗)等。 （2）基因工程藥物生產(chǎn)：如EPO等。 （3）抗體藥物、基因治療藥物生產(chǎn)。 （4）細(xì)胞工程藥物生產(chǎn)：生物細(xì)胞內(nèi)的一些生物活性多肽，生物活性物質(zhì)等。 （5）利用細(xì)胞法體外測(cè)定生物活性物質(zhì)的活性；并預(yù)測(cè)其在體內(nèi)的藥效和替代體內(nèi)法檢測(cè)其成品的生物活性。 三、細(xì)胞培養(yǎng)基的定義 人工模擬細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，維持細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),它是提供細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)。包括： 1． 天然培養(yǎng)基 指來自動(dòng)物體液或利用組織分離提取的一些培養(yǎng)基，如動(dòng)物血漿、胚胎浸出液、血清和人血清，水解乳蛋白等。 2． 合成培養(yǎng)基 人工設(shè)計(jì)、配制的培養(yǎng)基，如MEM、199、DMEM、RPMI1640等。 四、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)平臺(tái)
動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)已成為生物制藥領(lǐng)域最重要的關(guān)鍵技術(shù)之一，并以其研究的深入和進(jìn)展推動(dòng)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展。專家預(yù)言：蛋白治療藥物如糖蛋白、抗體和多肽藥物僅僅只是剛剛開始進(jìn)入市場(chǎng)，預(yù)計(jì)在下一個(gè)10年或20年會(huì)有更為快速的發(fā)展。屆時(shí)，蛋白治療藥物的迅速增長(zhǎng)和市場(chǎng)需求將遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過全世界的生產(chǎn)能力。 動(dòng)物細(xì)胞規(guī)?；a(chǎn)重組蛋白和抗體的工藝選擇可考慮使用當(dāng)前較成熟的工業(yè)化支持技術(shù)平臺(tái)，以縮短產(chǎn)品工藝研發(fā)的時(shí)間，加快工業(yè)化進(jìn)程。當(dāng)前已獲FDA批準(zhǔn)的生物技術(shù)產(chǎn)品以及公開發(fā)表的生產(chǎn)工藝中，占有主流優(yōu)勢(shì)的是攪拌式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)，工藝設(shè)計(jì)是流加或灌注培養(yǎng)。其大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)所面臨的挑戰(zhàn)是獲得最大生產(chǎn)力的同時(shí)注重維持產(chǎn)品的質(zhì)量；去除所有培養(yǎng)環(huán)境中外源因子的污染；更為精確有效的工藝控制手段；規(guī)?；囵B(yǎng)中氧氣的限定與溶解CO2濃度累積的控制等。 1996年1月至2002年12月美國(guó)獲得成功批準(zhǔn)的不同的治療劑和診斷劑產(chǎn)品共31種，其中用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的就有21種。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成為一個(gè)受到普遍信任的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)，并逐步形成商業(yè)化操作水平。 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)集中在細(xì)胞系、細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞生物反應(yīng)容器三個(gè)方面，構(gòu)成生物制品生產(chǎn)的必要條件。 其中細(xì)胞是病毒、蛋白的表達(dá)載體，細(xì)胞質(zhì)量直接影響蛋白的表達(dá)量或病毒的滴度，故篩選、馴化優(yōu)質(zhì)細(xì)胞是關(guān)鍵。而只有好的細(xì)胞培養(yǎng)基才可能篩選、馴化出優(yōu)質(zhì)的細(xì)胞。 細(xì)胞生物反應(yīng)容器也在不斷發(fā)展，以轉(zhuǎn)瓶、反應(yīng)器為主要細(xì)胞生產(chǎn)設(shè)備，配合高密度培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)技術(shù)，均需要相適應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基以充分發(fā)揮作用,獲得高表達(dá)、高產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。 清大天一公司致力于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的開發(fā)和服務(wù)，跟隨生物技術(shù)的發(fā)展，針對(duì)各種生物制品特點(diǎn)不斷開發(fā)針對(duì)性培養(yǎng)基新產(chǎn)品，建立多種細(xì)胞體系的疫苗、抗體藥物生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)平臺(tái)，以提高相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)水平和生物制品表達(dá)水平，促進(jìn)生物制藥發(fā)展。 ? 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)生物制品成本的影響 1． 表達(dá)量提高 通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷改進(jìn)可以充分利用現(xiàn)有設(shè)備，大幅度提高生物制品表達(dá)量，降低生物制品的單位制造成本；同時(shí)，由于產(chǎn)量提高并不新增固定資產(chǎn)投資，也帶來生物制品的單位固定成本的降低。 因此提高表達(dá)量可以有效降低生物制品的單位成本，既降低變動(dòng)成本，也降低固定成本，使得制品利潤(rùn)率提高，市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)能力增強(qiáng)。 2． 培養(yǎng)液成本降低 在很多使用牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液中，為牛血清支付的成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于培養(yǎng)液中的細(xì)胞培養(yǎng)基等其它成分，因此通過采用低血清細(xì)胞培養(yǎng)基，降低牛血清用量，可以降低細(xì)胞培養(yǎng)液總成本。 3． 純化成本低，制品安全性提高 牛血清的使用量不僅增加了細(xì)胞培養(yǎng)液的成本，更嚴(yán)重的是帶來動(dòng)物來源成分、雜蛋白，以及不安全因素，這些成分越多，純化的成本越高、生物制品原液損失越大，生物制品的成本越大。因此采用低血清、無血清培養(yǎng)細(xì)胞可以有效降低純化成本何損失，提高生物制品成品率和利潤(rùn)率。 4． 綜合成本降低 綜上所述，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生物制品產(chǎn)業(yè)化的核心技術(shù)之一，在生產(chǎn)中，應(yīng)該系統(tǒng)、全面的研究細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)生物制品成本的綜合影響，不斷追求最佳的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，提高生產(chǎn)效率，有效降低生物制品成本，提高利潤(rùn)率，增強(qiáng)產(chǎn)品市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。 五、細(xì)胞生存條件
1． 基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) （1） 糖 六碳糖主要能源、維持滲透壓，含葡萄糖1-5%。 （2） 氨基酸 維持生存需12種氨基酸（精、胱、亮、異亮、賴、蛋、苯丙、蘇、色、組、酪、纈）。谷氨酰胺需量最大,缺乏時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)不良。 單細(xì)胞培養(yǎng)或細(xì)胞量少時(shí),所需氨基酸的種類和量增多，細(xì)胞主要利用左旋氨基酸異構(gòu)體。 （3） 維生素 細(xì)胞大部分需水溶性B族維生素，Vitc不可少，1-10mg/100ml可促進(jìn)正常細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖。 2． 促生長(zhǎng)因子、激素類物質(zhì) 3． 其它物質(zhì) 基本元素、微量元素、促細(xì)胞貼附物質(zhì)(纖粘連蛋白、層粘連蛋白laminin、IV型膠原、氨基多糖類) 4． 水 主要成分和生存環(huán)境,要求高純度水。 5． 溫度 哺乳動(dòng)物及人源細(xì)胞最適培養(yǎng)溫度為35℃—37℃,對(duì)低溫耐受力比高溫強(qiáng)。39℃以上受損→死亡；不低于0℃時(shí)（0℃-34℃），細(xì)胞能生存，但代謝降低、分裂延緩。 6． 氣體環(huán)境和pH 需O2、CO2，通氧量過大對(duì)細(xì)胞有毒害。 CO2主要與維持pH有關(guān)，細(xì)胞培養(yǎng)最佳pH為7.2—7.4，通過緩沖系統(tǒng)和調(diào)節(jié)CO2含量，維持正常pH。 開放培養(yǎng)要求5%CO2環(huán)境、HEPES(羥乙基哌嗪乙硫磺酸)10—50mmol/ml可防止pH變化。 含Earle’s緩沖系統(tǒng)的培養(yǎng)基適合于5％CO2的培養(yǎng)條件，Hanks’緩沖系統(tǒng)的培養(yǎng)基僅含有0.35g/L NaHCO3，不能用于5％CO2的環(huán)境，若放入CO2培養(yǎng)箱，溶液將迅速變酸，使用時(shí)應(yīng)注意。 7． 濕度和光 開放培養(yǎng)相對(duì)濕度控制在95%。細(xì)胞培養(yǎng)需避光，紫外線或可見光可造成核黃素、酪氨酸、色氨酸等產(chǎn)生有毒的光產(chǎn)物，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，降低其貼壁能力。 8． 影響細(xì)胞生長(zhǎng)的其它因素 接觸橡膠用品、收集細(xì)胞時(shí)離心速度過大、細(xì)胞接種濃度過低等。 六、細(xì)胞培養(yǎng)基的基本要求
1． 營(yíng)養(yǎng)成分 氨基酸、單糖、維生素、無機(jī)離子與微量元素。 2． 促生長(zhǎng)因子及激素 3． 滲透壓 4． pH 5． 無毒、無污染 七、細(xì)胞培養(yǎng)基組成及作用 1． 氨基酸 組成蛋白質(zhì)的基本單位。不同種類的細(xì)胞對(duì)氨基酸的要求各異，但有幾種氨基酸細(xì)胞自身不能合成，必須依靠培養(yǎng)液提供，這幾種氨基酸稱為必需氨基酸。其中谷氨酰胺是細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)不良而死亡。 必需氨基酸包括L-谷氨酰胺、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-纈氨酸等。 2． 維生素 維持細(xì)胞生長(zhǎng)的生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞代謝中起調(diào)節(jié)及控制作用。在細(xì)胞培養(yǎng)中，盡管血清是維生素重要來源， 但是許多培養(yǎng)基中添加了各種維生素以適合更多的細(xì)胞系生長(zhǎng)。 ? 脂溶性維生素如：A、D、E、K。 ? 水溶性維生素如：B1、B2、B6、B12、泛酸、葉酸、生物素、C、煙酰胺等。 許多維生素參與構(gòu)成各種酶的活性基團(tuán)的成分，沒有它們，酶便沒有活性，代謝活動(dòng)將無法進(jìn)行。 VA是細(xì)胞合成糖蛋白時(shí)寡糖基的載體，對(duì)上皮細(xì)胞有重要的維護(hù)作用。VD參與調(diào)節(jié)鈣的吸收。VE是抗氧劑，可防止組成生物膜的磷脂中不飽和脂肪酸被氧化。VK缺乏會(huì)引起低凝血酶原及凝血時(shí)間延長(zhǎng)。 葉酸是合成四氫葉酸的重要原料，四氫葉酸在核酸的生物合成和蛋白質(zhì)的生物合成過程中起重要作用。 生物素是一些特異羧化酶的組成部分，參與糖代謝和脂肪酸的合成過程。 3． 碳水化合物 碳水化合物是細(xì)胞生長(zhǎng)主要能量來源，其中有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉和醋酸等。 4． 無機(jī)離子 鈉、鉀、鎂、鈣、磷等基本的無機(jī)離子，這些都是細(xì)胞組成所必須并參與細(xì)胞的代謝。 培養(yǎng)液中無機(jī)鹽的主要功能是幫助細(xì)胞維持滲透壓平衡。此外，通過提供鈉，鉀和鈣離子，幫助細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞膜功能。培養(yǎng)液的滲透壓是一個(gè)非常重要的因素, 細(xì)胞通常可耐受260mOsm/kg −320 mOsm/kg。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液的滲透壓在此范圍內(nèi)波動(dòng)。特別注意：向培養(yǎng)液中加入其它物質(zhì)有可能會(huì)明顯改變培養(yǎng)液的滲透壓，特別是溶于強(qiáng)酸或強(qiáng)堿中的物質(zhì)。 Na+是細(xì)胞外液中最主要的陽(yáng)離子，對(duì)維持滲透壓的恒定有決定性的作用。K +主要分布在細(xì)胞內(nèi)液，細(xì)胞內(nèi)K +的對(duì)于激活某些酶是必需的，它在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的酸堿平衡也有極重要意義。 Ca2+ 在細(xì)胞外液中的作用是將組織內(nèi)部細(xì)胞之間相互粘著，在細(xì)胞內(nèi)參與許多重要的細(xì)胞生理活動(dòng)，如傳導(dǎo)、參與肌肉細(xì)胞收縮等。 Mg2+ 是構(gòu)成細(xì)胞間質(zhì)的重要成分，對(duì)于細(xì)胞間相互穩(wěn)定結(jié)合有很重要的意義。磷的化合物對(duì)細(xì)胞物質(zhì)代謝和生理功能調(diào)控的功用是十分廣泛而不可缺少。 八、細(xì)胞培養(yǎng)基發(fā)展趨勢(shì) 1． 無血清培養(yǎng)基 是設(shè)計(jì)用來在無血清條件下促使特殊類型的細(xì)胞生長(zhǎng)或進(jìn)行專門應(yīng)用的培養(yǎng)基。需要添加生長(zhǎng)因子和/或細(xì)胞因子，含有個(gè)別蛋白或大量蛋白組分。其主要優(yōu)點(diǎn)： ? 增加確定性； ? 性能更一致； ? 容易進(jìn)行純化和下游加工； ? 提高制品安全性和/或產(chǎn)量。 2． 無蛋白培養(yǎng)基 培養(yǎng)基中沒有添加蛋白，但仍然可能包含一些動(dòng)物或植物來源的成分（如低分子量肽的各種水解物）。 3． 化學(xué)限定培養(yǎng)基 培養(yǎng)基中不包含有蛋白、水解產(chǎn)物或未知結(jié)構(gòu)的組分，所有的成分均有已知的化學(xué)結(jié)構(gòu)。 九、培養(yǎng)基的品質(zhì)
1． 外觀 顏色、粉末細(xì)度須均勻。 2． 溶解性 培養(yǎng)基完全溶解，可以避免培養(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)成分的流失。 3． pH值 哺乳類動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)需要合適的酸堿度，同時(shí)pH值的測(cè)定也可以檢查培養(yǎng)基的批間差異。 4． 水分 培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成份很豐富，利于微生物的滋長(zhǎng)，因此水分的含量控制可以延長(zhǎng)有效期。 5． 冰點(diǎn)滲透壓 細(xì)胞必須生活在合適的滲透壓環(huán)境中；同時(shí)滲透壓值的測(cè)定也可以檢查培養(yǎng)基的批間差異。 6． 菌落總數(shù) 粉末培養(yǎng)基不是無菌制劑，培養(yǎng)基本身的營(yíng)養(yǎng)成分很豐富，容易滋生微生物，因此菌落的控制可以延長(zhǎng)有效期 7． 細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn) 可檢查細(xì)胞培養(yǎng)基是否有促生長(zhǎng)的能力，以及是否有不利細(xì)胞生長(zhǎng)的毒素。 8． 細(xì)菌內(nèi)毒素 為滿足生物制品細(xì)菌內(nèi)毒素的控制要求，作為生物制品生產(chǎn)原料的培養(yǎng)基同樣需要細(xì)菌內(nèi)毒素控制。 9． 穩(wěn)定性 確定產(chǎn)品的儲(chǔ)存、運(yùn)輸條件，產(chǎn)品的保質(zhì)期限。 10． 一致性 驗(yàn)證產(chǎn)品的均一性。 十、常見問題解答 1． 如何選用培養(yǎng)基？ 選擇培養(yǎng)基沒有一定標(biāo)準(zhǔn)，有幾點(diǎn)建議可供參考： （1） 建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基?？梢圆殚單墨I(xiàn)，或在購(gòu)買細(xì)胞株時(shí)咨詢。 （2） 本單位慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞。 （3） 根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要來選擇培養(yǎng)基。如小鼠細(xì)胞株多選1640；進(jìn)行細(xì)胞雜交、基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，可選擇IMDM。 （4） 用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，可以用生長(zhǎng)曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。 2． 選擇便宜的培養(yǎng)基品種成本就低嗎？ （1） 通常，培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞，細(xì)胞也可以在不同培養(yǎng)液中生長(zhǎng)；例如在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(zhǎng)。 （2） 培養(yǎng)基養(yǎng)份不同會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)效果不同，病毒或蛋白表達(dá)不同，應(yīng)該選擇效果最好的培養(yǎng)基，考慮生物制品的綜合成本； （3） 最終目的是追求生物制品的得率——得率高則成本低。 3． L－谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？ L－谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的，脫掉氨基后， L－谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源，參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。 但L－谷氨酰胺在溶液中不穩(wěn)定，在高溫下會(huì)分解成吡咯烷酮和羧酸，也有一些毒降解產(chǎn)物如NH4+會(huì)不可逆轉(zhuǎn)地?fù)p壞細(xì)胞壁。 L-谷氨酰胺在不同溫度、不同pH值條件下的穩(wěn)定性研究如下。   4． 為什么培養(yǎng)基中可以省去酚紅？
酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為pH值的指示劑，研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素），為避免固醇類反應(yīng)，用無酚紅培養(yǎng)基。 5． 在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，有效期是多長(zhǎng)？ 一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí)，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_始降解。 6． 為什么不要用碳酸氫鈉調(diào)pH值？ 如圖所示，培養(yǎng)基pH值隨著碳酸氫鈉量的增加，呈拋物線增長(zhǎng)，當(dāng)碳酸氫鈉加到一定量時(shí)，pH變化越來越小。而培養(yǎng)基的滲透壓值隨著碳酸氫鈉量的增加，呈直線增長(zhǎng)，碳酸氫鈉量越大，滲透壓值越大。 如果為了達(dá)到工作pH值僅加入少量的碳酸氫鈉，而忽略滲透壓，一來可能會(huì)達(dá)不到緩沖效果而引起細(xì)胞培養(yǎng)過程中pH值變化較劇烈，二來會(huì)使培養(yǎng)基成為低滲溶液，在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)易造成細(xì)胞膨脹破裂；如果為了達(dá)到工作pH值而加入大量碳酸氫鈉，一來可能會(huì)難以達(dá)到期望的pH值，二來會(huì)使培養(yǎng)基成為高滲溶液，在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)易造成細(xì)胞萎縮。 生產(chǎn)中最好通過實(shí)驗(yàn)找到合適滲透壓和pH值情況下的碳酸氫鈉加入量。下面是DMEM(HED)和MEM培養(yǎng)基的碳酸氫鈉與pH值、滲透壓的曲線。   7． 細(xì)胞生長(zhǎng)質(zhì)量很好，為什么病毒、蛋白表達(dá)量沒有提高？
細(xì)胞生長(zhǎng)質(zhì)量高是高表達(dá)的必要條件。 采用細(xì)胞生產(chǎn)的疫苗是體外培養(yǎng)一定量的動(dòng)物細(xì)胞并接種病毒，利用病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖，得到預(yù)期的病毒抗原，然后制成疫苗。細(xì)胞生長(zhǎng)質(zhì)量包括細(xì)胞密度和形態(tài)，沒有好的細(xì)胞生長(zhǎng)質(zhì)量就不可能有高的表達(dá)量。 但要注意的是，細(xì)胞生長(zhǎng)質(zhì)量好、密度厚度大時(shí)候病毒接種量也應(yīng)該相應(yīng)增大，表達(dá)量才會(huì)提高，否則前期的高質(zhì)量細(xì)胞培養(yǎng)就可能浪費(fèi)了。 同時(shí)病毒、蛋白的表達(dá)、分泌在一定濃度下可能會(huì)飽和，因此如欲獲得高表達(dá)，還須研究合適的收液時(shí)間和次數(shù)。 8． 污染是培養(yǎng)基質(zhì)量不好引起的嗎？ （1） 培養(yǎng)基不是無菌產(chǎn)品，但有菌落數(shù)量控制。 （2） 培養(yǎng)基在使用前通過高壓或過濾滅菌。 （3） 防止污染應(yīng)該注意以下事項(xiàng)： A. 從污染的源頭開始 ? 確認(rèn)工作細(xì)胞庫(kù)是否被污染：用細(xì)菌、真菌及支原體無菌試驗(yàn)來確認(rèn)并排除。同時(shí)要對(duì)無菌試驗(yàn)培養(yǎng)基的靈敏度進(jìn)行驗(yàn)證。 ? 確認(rèn)毒種工作種子批是否被污染：用細(xì)菌、真菌及支原體無菌試驗(yàn)來確認(rèn)并排除。同時(shí)要對(duì)無菌試驗(yàn)培養(yǎng)基的靈敏度進(jìn)行驗(yàn)證。 ? 確認(rèn)所用培養(yǎng)基及其添加成分（如小牛血清、NaHCO3等）是否被污染：用細(xì)菌、真菌及支原體無菌試驗(yàn)來確認(rèn)并排除。同時(shí)要對(duì)無菌試驗(yàn)培養(yǎng)基的靈敏度進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)際生產(chǎn)中，可以從配制好的培養(yǎng)液中取少量加入營(yíng)養(yǎng)瓊脂于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48小時(shí)即可觀察有無污染。 一些單位在使用血清時(shí)候往往不經(jīng)過過濾除菌處理便直接加入到培養(yǎng)液中，可能帶來污染。 ? 其它：高壓滅菌設(shè)備、過濾除菌設(shè)備均應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證，確保滅菌和除菌效果；前者應(yīng)在投產(chǎn)前及其后的每6個(gè)月進(jìn)行驗(yàn)證，后者應(yīng)在每次除菌前、后進(jìn)行驗(yàn)證工作（至少應(yīng)在除菌后進(jìn)行一次）。 ? 另外，應(yīng)將有毒區(qū)與無毒區(qū)嚴(yán)格分開，并有各自獨(dú)立的空氣凈化系統(tǒng)及孵室，有毒區(qū)對(duì)無毒區(qū)應(yīng)保持相對(duì)負(fù)壓，防止病毒對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞（尤其是細(xì)胞庫(kù)）的污染。 B. 從GMP管理、SOP操作方面加強(qiáng)管理力度 ? 每二周（或每周）對(duì)無菌操作室及潔凈區(qū)域按GMP要求進(jìn)行檢測(cè) ? 人員的GMP管理和無菌操作強(qiáng)化培訓(xùn) C. 一些特殊情況 ? 細(xì)菌的大小從0.1-700μm，為防止細(xì)小細(xì)菌的污染，過濾除菌應(yīng)盡量采用0.1μm的濾膜或?yàn)V芯。 ? 大面積污染時(shí)，應(yīng)對(duì)所有設(shè)施、用具及操作環(huán)境進(jìn)行徹底消毒。 9． 如何消除組織培養(yǎng)的污染？ 當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時(shí)，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開，用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái)，檢查HEPA過濾器。 高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。 （1） 在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。 （2） 分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0，8.0 mg/ml。 （3） 每天觀測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。 （4） 確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2－3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2－3代。 （5） 在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。 （6） 重復(fù)步驟4。 （7） 在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4－6代，確定污染是否已被消除。 十一、培養(yǎng)基
培養(yǎng)基產(chǎn)品分為細(xì)胞培養(yǎng)基、平衡鹽、細(xì)菌培養(yǎng)基產(chǎn)品。 （一） 平衡鹽（balanced salt solution，BSS） 1885年Sydney Ringer開發(fā)生理鹽水發(fā)展而來，由無機(jī)鹽、葡萄糖和水組成。平衡鹽通常以其發(fā)明者命名，基本平衡鹽溶液都是基于細(xì)胞需要鈉、鉀、鈣、鎂和磷酸鹽這5種離子開發(fā)而來，只是在離子濃度和鹽的形式上有所區(qū)別。 平衡鹽的主要功能是維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡、控制和維持酸堿平衡在生理范圍之內(nèi)、提供能量和代謝所需的無機(jī)離子。平衡鹽培養(yǎng)基可用于配制培養(yǎng)用液基礎(chǔ)液及細(xì)胞洗滌液。常用的平衡鹽有： 1． Dulbecco,s平衡鹽（D-PBS），不含碳酸氫鈉； 2． Hanks,平衡鹽（HBSS），含碳酸氫鈉少，約0.35mg/L； 3． Earle,s平衡鹽（EBSS），含碳酸氫鈉多，約2.2mg/L； 4． PBS平衡鹽，無Ca2+、Mg2+離子。 （二） 細(xì)胞培養(yǎng)基 1． 傳統(tǒng)基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基及其改良培養(yǎng)基 基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基通常指基礎(chǔ)合成培養(yǎng)基，主要成分為氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽、輔助物質(zhì)（核酸降解物、氧化還原劑等）。 據(jù)不同細(xì)胞和研究目的，選用合適培養(yǎng)基,還可補(bǔ)加新成分。如雜交瘤中常用DMEM加丙酮酸鈉、2-巰基乙醇（相當(dāng)于胎牛血清可透析組分的作用）。 合成培養(yǎng)基使用時(shí)加5-30%血清。 （1） 199細(xì)胞培養(yǎng)基及其改良品種 1950年由Morgan等設(shè)計(jì)，除BSS外，含有53種成分，添加適量的血清后，可廣泛用于多種細(xì)胞培養(yǎng)、病毒學(xué)、疫苗生產(chǎn)等。 199（HB）細(xì)胞培養(yǎng)基，主要應(yīng)用于Vero細(xì)胞、地鼠腎細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)狂犬、乙腦等疫苗，具有高緩沖性能，能夠有效提高病毒滴度。 ? 改良199細(xì)胞培養(yǎng)基——199（HB）細(xì)胞培養(yǎng)基 狂犬疫苗生產(chǎn)實(shí)踐證明，199（HB）細(xì)胞培養(yǎng)基與傳統(tǒng)199細(xì)胞培養(yǎng)基相比，具有以下優(yōu)勢(shì)。 a) 細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)好 用199（HB）細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)速度相對(duì)較快，形態(tài)良好。  b) 營(yíng)養(yǎng)液的pH較穩(wěn)定 用199（HB）細(xì)胞培養(yǎng)基配制病毒維持液pH值較穩(wěn)定，經(jīng)過3－4天的細(xì)胞培養(yǎng)后pH值變化小。 c) 病毒原液滴度高 用199（HB）細(xì)胞培養(yǎng)基收獲的病毒原液相對(duì)用199培養(yǎng)基收獲的病毒原液平均滴度要高，尤其對(duì)二次苗的影響。  （2） BME細(xì)胞培養(yǎng)基
基礎(chǔ)Eagle培養(yǎng)基（Basal Medium Eagle），1955年由Eagle設(shè)計(jì)，BSS＋12種氨基酸＋谷氨酰胺＋8種維生素。簡(jiǎn)單、便于添加，適于各種傳代細(xì)胞系和特殊研究用，在此基礎(chǔ)上改良的細(xì)胞培養(yǎng)基品種有MEM、DMEM、IMDM等。 （3） MEM細(xì)胞培養(yǎng)基 低限量Eagle培養(yǎng)基（Minimal Essential Medium），1959年修改配方，刪去賴氨酸、生物素，增加氨基酸濃度，適合多種細(xì)胞單層生長(zhǎng)，是一種最基本、適用范圍最廣的培養(yǎng)基，是一種被廣泛應(yīng)用的培養(yǎng)基。 需要注意的是，MEM細(xì)胞培養(yǎng)基有含Earle's平衡鹽的類型，也有含Hanks'平衡鹽的類型；有高壓滅菌型的，也有過濾除菌型的；還有含非必需氨基酸的類型。生產(chǎn)和科研時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況注意選擇合適的MEM細(xì)胞培養(yǎng)基。 另外，因MEM培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分所限，針對(duì)生產(chǎn)之特定細(xì)胞培養(yǎng)與表達(dá)時(shí)，并不一定是使用效果最佳或者最經(jīng)濟(jì)的培養(yǎng)基。 （4） DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基及其改良品種 DMEM由Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基，各成份量加倍，分低糖（1000mg/L）、高糖（4500mg/L）。細(xì)胞生長(zhǎng)快。附著稍差的腫瘤細(xì)胞、克隆培養(yǎng)用高糖效果較好，常用于雜交瘤的骨髓瘤細(xì)胞和DNA轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)。例如CHO細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)乙肝疫苗、CHO細(xì)胞表達(dá)EPO。 ? 改良DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基——DMEM（HED）細(xì)胞培養(yǎng)基 DMEM（HED）細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)CHO細(xì)胞生產(chǎn)乙肝疫苗，具有較強(qiáng)細(xì)胞維持能力，可增加收液次數(shù)，有效提高蛋白表達(dá)率。 生產(chǎn)和試驗(yàn)研究證明，DMEM（HED）細(xì)胞培養(yǎng)基在細(xì)胞生長(zhǎng)和病毒分泌方面均優(yōu)于使用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基。 a) 使用DMEM（HED）細(xì)胞培養(yǎng)基細(xì)胞貼壁和長(zhǎng)滿單層時(shí)間明顯快于傳統(tǒng)DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，維持2個(gè)月細(xì)胞未出現(xiàn)脫落現(xiàn)象。 使用DMEM（HED）細(xì)胞培養(yǎng)基，在接種后第2天， 80％細(xì)胞已伸展并開始分裂增殖，第3天已長(zhǎng)成較密單層，細(xì)胞貼壁均勻，形態(tài)清晰，呈多邊形和梭形，細(xì)胞間略有空隙，細(xì)胞數(shù)為7.5 x 106個(gè)／ml。在此后轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的60 d內(nèi)細(xì)胞數(shù)保持穩(wěn)定，無明顯增加和減少，無脫落，無明顯形態(tài)變化，培養(yǎng)液中HBsAg滴度穩(wěn)定在1：128～1：512之間。 而使用傳統(tǒng)DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，只有30％和40％的細(xì)胞伸展，至第4天才長(zhǎng)成較密單層，小方瓶與雙層轉(zhuǎn)瓶結(jié)果相同。至30 d 時(shí)已長(zhǎng)成較厚的復(fù)層，并開始大片脫落，細(xì)胞數(shù)明顯減少，HBsAg滴度降低，最低降到1：32 。此后細(xì)胞開始重新貼壁、增殖，至45 d左右部分細(xì)胞長(zhǎng)成單層，一部分細(xì)胞因脫落，至60 d時(shí)仍未能長(zhǎng)滿轉(zhuǎn)瓶。  （5） IMDM細(xì)胞培養(yǎng)基
IMDM是由Iscove's改良的Eagle培養(yǎng)基，增加了幾種氨基酸和胱氨酸量。可用于雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)，以及無血清培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。 （6） RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基 Moore等人于1967年在Roswell Park Memorial Institute研制，針對(duì)淋巴細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)，BSS＋21種氨基酸＋維生素11種等，廣泛適于許多種正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，也用做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。 （7） Fischer’s細(xì)胞培養(yǎng)基 用于白血病微粒細(xì)胞培養(yǎng)。 （8） HamF10、F12細(xì)胞培養(yǎng)基 1963年、1969年由Ham設(shè)計(jì)，含微量元素，可在血清含量低時(shí)用，適用于克隆化培養(yǎng)。F10適用于倉(cāng)鼠、人二倍體細(xì)胞，F(xiàn)12適用于CHO細(xì)胞。 （9） DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基 DMEM和F12細(xì)胞培養(yǎng)基按照1:1比例混合效果最佳，營(yíng)養(yǎng)成分豐富，且可以使用較少血清，或作為無血清培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。 2． 低血清細(xì)胞培養(yǎng)基 血清對(duì)于在傳統(tǒng)培養(yǎng)基配方中生長(zhǎng)和增殖的大多數(shù)細(xì)胞系來說是必不可少的。大部分的組織培養(yǎng)研究者非常熟悉血清添加物給予基本培養(yǎng)基配方的良好生長(zhǎng)支持特征。然而，伴隨血清的使用也帶來了很多的問題。 ? 費(fèi)用因素 生產(chǎn)血清費(fèi)用高而效率低。小牛血清還必須來源于沒有瘋牛病、口蹄疫和其它高度傳染性疾病的地區(qū)。 ? 差異 所有的血清都是一種成分不確定的混合物，血清批與批之間的組分存在差異。 ? 傳染源 動(dòng)物血清有可能攜帶傳染源，包括支原體、病毒和有毒物質(zhì)。任何一種傳染源可能對(duì)正在生長(zhǎng)的細(xì)胞系或者制品帶來風(fēng)險(xiǎn)。 ? 法規(guī)問題 為了使與傳染源相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)減少到最低，存在多個(gè)國(guó)家間進(jìn)出口生物材料的國(guó)際法規(guī)。 為了解決這些問題，清大天一公司開發(fā)了多種營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，以最小化和消除與使用動(dòng)物血清相關(guān)的制品安全性問題。 （1） 低血清細(xì)胞培養(yǎng)基的原理 通常在用傳統(tǒng)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)須加入約10％的小牛血清，低血清培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加了額外的營(yíng)養(yǎng)成分，使小牛血清的添加量減少50％到70％，而對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、形態(tài)和功能有較小或者沒有影響。 （2） 低血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn) ? 小牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)液成本最大的原料，使用低血清培養(yǎng)基明顯地節(jié)省培養(yǎng)液成本。 ? 減少制品純化損失，提高純化收率，便于分離純化。 ? 減少由于不確定蛋白或者其它血清組分帶來干擾和差異的風(fēng)險(xiǎn)。 ? 提高制品安全性。 ? 批間差減少或影響降低： a) 血清用量減少可以減少使用批次。 b) 血清用量減少使得批間差的影響減少。 ? 細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基的生長(zhǎng)相當(dāng)或者優(yōu)于加入10％小牛血清的傳統(tǒng)培養(yǎng)基，沒有觀察到在細(xì)胞形態(tài)及增殖方面的顯著差異。 （3） 低血清細(xì)胞培養(yǎng)基的應(yīng)用 VERO細(xì)胞、BHK21細(xì)胞等細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶、微載體反應(yīng)器中的培養(yǎng)。 5． 無血清無動(dòng)物組分細(xì)胞培養(yǎng)基 無血清無動(dòng)物組分細(xì)胞培養(yǎng)基意指以該培養(yǎng)基配制的培養(yǎng)液無須添加牛血清即可培養(yǎng)細(xì)胞和維持生長(zhǎng)收液，且該培養(yǎng)基成分中不含有任何動(dòng)物來源成分。 在細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品過程中無須添加動(dòng)物來源成分，避免瘋牛病、口蹄疫等傳播進(jìn)入人體，減少人、獸在使用生物制品時(shí)的特異性免疫反應(yīng)、降低產(chǎn)品成本（如降低培養(yǎng)液成本，簡(jiǎn)化下游純化工作及提高產(chǎn)品收獲量等）。采用生物反應(yīng)器、無血清無動(dòng)物來源成分培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)制藥是21世紀(jì)生物制藥發(fā)展趨勢(shì)；美國(guó)FDA和美國(guó)農(nóng)業(yè)部已經(jīng)嚴(yán)格控制在細(xì)胞培養(yǎng)中胎牛血清的使用。 同時(shí)，高密度細(xì)胞培養(yǎng)并長(zhǎng)時(shí)間維持細(xì)胞密度是高表達(dá)率和高產(chǎn)量的關(guān)鍵，只能通過無血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。 為了獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)成分，無血清無動(dòng)物組分細(xì)胞培養(yǎng)基中氨基酸含量倍增，另外添加了生長(zhǎng)因子和/或細(xì)胞因子，以及含有個(gè)別蛋白或大量蛋白的組分。 無血清無動(dòng)物組分細(xì)胞培養(yǎng)基通常是特定細(xì)胞專用培養(yǎng)基，如無血清無動(dòng)物組分CHO懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基適用于CHO懸浮細(xì)胞。 6． 替代天然培養(yǎng)基
培養(yǎng)基中不包含有蛋白、水解產(chǎn)物或未知結(jié)構(gòu)的組分，所有的成分均有已知的化學(xué)結(jié)構(gòu)。 （三） 細(xì)菌培養(yǎng)基 細(xì)菌培養(yǎng)基為肺炎、流腦等細(xì)菌培養(yǎng)疫苗生產(chǎn)專用培養(yǎng)基。用于細(xì)菌性疫苗大規(guī)模生產(chǎn)中細(xì)菌體的培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)室中細(xì)菌體的研究培養(yǎng)。 目前細(xì)菌性疫苗生產(chǎn)廠家及實(shí)驗(yàn)室都使用自行配制的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌體的繁殖培養(yǎng)，由于配制工藝的不同、各種培養(yǎng)基組分來源不同，以及培養(yǎng)基中重要活性添加劑來源的質(zhì)量不穩(wěn)定性，導(dǎo)致了細(xì)菌體繁殖培養(yǎng)的數(shù)量和質(zhì)量不穩(wěn)定，批間差較大，結(jié)果時(shí)好時(shí)壞，該結(jié)果不僅給培養(yǎng)基使用者增加了成本，還嚴(yán)重影響了疫苗生產(chǎn)廠家的產(chǎn)量和質(zhì)量，延誤科研進(jìn)程。 |
購(gòu)買進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物
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