一．材料
所需液體：Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、雙抗液、碳酸氫鈉液、鹽酸液。
試劑Trypsin,SDS,DMEM均購(gòu)于SigmaChemicalCo.小牛血清購(gòu)于杭州四季青生物制品有限公司，其余均為國(guó)產(chǎn)分析純。
取鼠：標(biāo)準(zhǔn)SD大鼠，鼠盆用棉鋪好，取鼠。
物品：白大衣、飯盒
小剪子、小鑷子（4套）（一套剪皮膚、一套開(kāi)胸取心，一套剔除心緣纖維組織，一套剪碎心臟）
瓶皿（2套）
250ml燒杯3個(gè)
500ml燒杯1個(gè)，用作廢液缸。
50ml燒杯3個(gè)（剪碎心肌組織，最后配液）
三角燒杯（50ml） 小轉(zhuǎn)子（小轉(zhuǎn)子，酒精擦，雙蒸水沖后，再把酒精徹底沖掉后用三角燒杯高壓）
離心管及帽（12-14個(gè)），兩個(gè)試管
吸管（5~8個(gè)）大鑷子（兩把，持物，例夾棉球等）
臺(tái)面：磁力攪拌器、紗布（事先用于托盤(pán)裝0.1％新潔爾滅浸泡）、試管架、泡沫塑料板、五個(gè)針頭（不用消毒）75％酒精棉球及碘酒（消毒棉球，泡酒精、碘酒）大鑷子兩把（一把夾棉球，一把取鼠）、3個(gè)250ml燒瓶（一個(gè)裝一蒸水，一個(gè)裝新潔爾滅，另一為空的備用）1個(gè)500ml燒瓶（廢液缸）、溫度計(jì)、PH試紙（事先調(diào)PH值）、酒精燈、打火機(jī)/火柴、載玻片（5-10個(gè)）、注射器5ml6個(gè)（胰酶、DMEM、小牛血清）1ml2個(gè)（雙抗液）20ml備用2個(gè)、微量加樣器1000ml及500ml
以上物品均用紫外線照30分鐘。
另外準(zhǔn)備手套、帽子、口罩、24孔培養(yǎng)板、離心機(jī)、未凍藥品及DMEM、HCL、NaHCO3、小牛血清。
事先把顯微鏡、離心機(jī)、磁力攪拌器電源插好。檢查酒精燈是否有酒精，碘酒和酒精棉球是否夠用。先把物品遞入，后穿大衣、帽子和口罩。然后把酒精燈打開(kāi)，把瓶皿擺好，再用一個(gè)瓶皿裝酒精棉球。
二．培養(yǎng)方法：
事先檢查顯微鏡、磁力攪拌器及離心機(jī)是否好用，提前三小時(shí)把小牛血清、胰酶、抗生素拿出來(lái)化開(kāi)。其余未凍藥品也提前20分鐘拿出來(lái)緩和一下。新潔爾滅（0.1％）泡紗布（用10ml5％的新潔爾滅加水至500ml即得），消毒地面（1：500的84液），用酒精棉球擦拭臺(tái)面后把物品擺放好，開(kāi)紫外線燈照30分鐘后開(kāi)鼓風(fēng)機(jī)吹至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。
具體方法為：
1.把兩個(gè)5ml注射器分別插入DMEM和胰酶中，分別向兩個(gè)圓皿中加入5ml的DMEM培養(yǎng)液。用一把大鑷子從鼠盆里取出一只生后2~3天的SD大鼠，放入0.1％新潔爾滅浸泡一下后拿出放在泡沫板上，用針頭把鼠固定（位置擺正），用另一把大鑷子取碘酒棉球擦皮膚，再用酒精棉球脫碘，取一把小剪子及小鑷子開(kāi)皮，充分撕拉開(kāi)，再用酒精棉球消毒，后換另一把小剪子和鑷子在劍突處正中線稍偏左開(kāi)胸取心。
2.取出的心放在剛才準(zhǔn)備的一個(gè)裝有DMEM的圓皿中再取下一只。重復(fù)以上過(guò)程。（鼠全部殺死后，把取鼠鑷及泡沫板、新潔爾滅缸等拿出臺(tái)面。消毒、清潔，鋪紗布、換手套。
3．用第三副剪子和鑷子把圓皿中的心臟周邊的血凝及纖維組織剔除掉，放在另一個(gè)預(yù)先裝好DMEM的圓皿中。抽取5ml的胰酶，然后將其中少許放入50ml的小燒杯中，大部分倒入三角燒瓶中。用第四副剪子將燒杯中的心臟剪成1mm3的碎塊，倒入三角燒瓶中（可用剪刀刮入），再用剩余胰酶刷凈燒杯。
4．把溫度計(jì)和三角燒杯放入250ml燒瓶中，（事先調(diào)好水量，多會(huì)沒(méi)過(guò)三角燒杯，少溫度會(huì)不均勻）。打開(kāi)磁力攪拌器電源，調(diào)溫度（使-緩慢加到34~35℃）和轉(zhuǎn)速（轉(zhuǎn)速不可過(guò)快，否則會(huì)打碎細(xì)胞，基本上標(biāo)志為平行）。一定要注意監(jiān)控。
5．溫度達(dá)到34℃時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，第一次為10分鐘，以后可為8分鐘，事情況而定。在此期間，在試管架上擺上5、6個(gè)離心管，標(biāo)上1、1，2、2。其中在1號(hào)兩管事先加入DMEM液各2毫升
6．10分鐘后，把三角燒瓶取下，磁力攪拌器關(guān)上，用一個(gè)吸管輕輕吹打（使消化下來(lái)的細(xì)胞徹底從組織團(tuán)快上掉下來(lái)），這個(gè)吸管（1）用后固定放在一個(gè)離心管中，以后每次消化后取下都用其吹打幾下，第一次上清棄去，然后向兩個(gè)1號(hào)管分別倒入2ml上清（盡量不要把組織倒出，也不要剩液太多，以免消化下的細(xì)胞重復(fù)消化造成損傷），用另一個(gè)吸管（2）混勻配平兩個(gè)管（即兩個(gè)管水平高度相同），輕輕吹打，以免損壞細(xì)胞。
7．接著把這兩個(gè)離心管放入離心機(jī)中，調(diào)10分鐘，800或1000轉(zhuǎn)，打開(kāi)關(guān)。
8．同時(shí)向三角燒瓶中加入5ml胰酶，繼續(xù)消化8分鐘，注意控制溫度。此時(shí)向兩個(gè)2號(hào)管中分別加入2mlDMEM液。
9．取下三角燒瓶，仍用1號(hào)吸管吹打，后靜置片刻向兩個(gè)2號(hào)管分別倒入2毫升的上清，取出兩個(gè)離心后的1號(hào)管，把上清液沿細(xì)胞貼壁一方慢慢倒掉，后向其中一管加入4ml的DMEM液，用2號(hào)吸管取少量液體加入另一個(gè)離心管中，把管底的沉淀細(xì)胞洗下來(lái)，把液體全部移入其中一管，三個(gè)管（1個(gè)1號(hào)管，兩個(gè)2號(hào)管）配平，放入離心管中，離心十分鐘。同時(shí)仍加5ml的胰酶，放入三角燒瓶中，繼續(xù)消化（注意控制溫度，達(dá)34℃時(shí)計(jì)時(shí)）。
10．消化到4次左右，吹打均勻后，吸一滴滴在載玻片上，拿到鏡下觀察消化情況，決定消化次數(shù)。
11．離心2次的吸管，放在試管架上，待離心過(guò)程全部完事后，把各管上清液倒掉，在各管加上3ml（不用精確，大致這樣）DMEM液，記住共加入多少DMEM液的量，換吸管（3號(hào)）把各管底細(xì)胞塊吸下吹打均勻后，移入50ml燒杯中，然后用注射器抽取余量的DMEM加入燒杯中，加入小牛血清及抗生素，換吸管（4號(hào)）吹打均勻。
12．取出24孔培養(yǎng)板，一個(gè)人吹打，另一個(gè)人用加樣器加藥。封蓋時(shí)過(guò)火，蓋上蓋，放在CO2孵箱。24小時(shí)后觀察是否貼壁。（生物秀實(shí)驗(yàn)頻道www.bbioo.com）
（24孔板，每孔最多加2ml，一般加液時(shí)每孔加1~1.5ml）
三．討論
乳鼠心肌細(xì)胞屬于原代生長(zhǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)程較為繁瑣。文獻(xiàn)上有多種濃度胰酶消化方法，我們?cè)谠囼?yàn)中摸索到0.06％濃度的胰酶對(duì)細(xì)胞損害較小，比起一些文獻(xiàn)記載的0.15％濃度有一定的優(yōu)越性，但這個(gè)濃度消化所需時(shí)間較長(zhǎng)，所以我們又采取多次反復(fù)低濃度消化的方法，每次消化一些后，用吸管抽取出上清液，離心所得即為心肌細(xì)胞。利用心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞貼壁時(shí)間的不同,采用差速貼壁1h,除去成纖維細(xì)胞，達(dá)到純化的目的。成纖維細(xì)胞胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀。很好和心肌細(xì)胞鑒別。
心肌細(xì)胞剛接種時(shí)形狀為圓形或橢圓形，大約在一天左右基本貼壁，此時(shí)細(xì)胞伸出偽足，偽足在鏡下為纖維狀條索，細(xì)胞胞體則呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，如多角形，部分細(xì)胞有聚集傾向，細(xì)胞搏動(dòng)效果較好，DMEM培養(yǎng)基在初始培養(yǎng)時(shí)為深紅色，兩天后變?yōu)榈S色，應(yīng)該是營(yíng)養(yǎng)成分下降的表現(xiàn)，也說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好。我們也參考了一些國(guó)外文獻(xiàn)的培養(yǎng)方法加以補(bǔ)充。
我們也拍攝了很多細(xì)胞的圖片，效果很清晰，但目前沒(méi)有在手頭上，以后有機(jī)會(huì)補(bǔ)上。
四．參考文獻(xiàn)
1.WangHX,ZhangWM,ShengJZ,WongTM.HighcarbacholincreasestheelectricallyinducedItransientinthesingleisolatedventricularmyocyteofrats.EurJPharmacol,1997；319：91-9
2.AnimalcellculturemethodseditedbyJennieP.MatherandDavidBarnes.--California:AcademicPress,c1998.--xiv,368p.24cmSBN0124800408:CNY619.26
|
