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細菌內(nèi)毒素檢查法作為控制藥品質(zhì)量的一種有效方法，已經(jīng)廣泛的被世界各國藥典收載。經(jīng)過30多年的不斷改進，無論是凝膠法還是光度法均比較成熟和完善。但是，在為新化合物或新藥建立細菌內(nèi)毒素檢查方法時，常常會遇到各種各樣的困難，尤其是尚處于新藥研發(fā)早期階段的藥物，由于藥物制劑、賦形劑等還不穩(wěn)定，經(jīng)常會發(fā)生變化，這樣就給方法的建立帶來不同程度的影響。在建立細菌內(nèi)毒素檢查法之前，應盡可能多的收集有關(guān)該藥品的基本信息，例如：有關(guān)樣品的溶解性信息，推薦的稀釋液，在水中的溶解度，以及最適溶劑；樣品的pH范圍；分子量大??；產(chǎn)品規(guī)格、體積或重量；擬用于臨床的用法和用量等等。以便選擇合適的樣品處理方法和內(nèi)毒素檢查方法，對于早期研發(fā)階段的藥物，應選擇合適的賦形劑，以有利于細菌內(nèi)毒素檢查中對樣品的稀釋處理。此外，在確定內(nèi)毒素限值時還應盡可能采用最大人擬用劑量，為臨床安全性和有效性研究中增加劑量留出空間。
一、細菌內(nèi)毒素檢查方法建立的主要步驟
對某一新化合物建立細菌內(nèi)毒素檢查方法時，首先應根據(jù)人體最大日給藥劑量和給藥途徑，計算和確定樣品的內(nèi)毒素限值，選擇合適的鱟試劑，根據(jù)臨床規(guī)格，計算最大有效稀釋倍數(shù)，稀釋產(chǎn)品，并在低于最大稀釋倍數(shù)的濃度下進行檢查?？梢圆捎媚z法，也可以采用終點法或動態(tài)法。當測定結(jié)果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠法為準。
1、細菌內(nèi)毒素限值的確定
一個藥品在投放市場前，它是否滿足內(nèi)毒素限值的要求？樣品的內(nèi)毒素含量具體是多少？這些問題不但關(guān)注用藥安全，還應該最大限度的提供有關(guān)內(nèi)毒素含量的準確信息，為藥品生產(chǎn)過程中質(zhì)量控制提供警戒信息。盡管細菌內(nèi)毒素檢查方法的建立是一個科學方法的研究過程，但其最終目的還是要為控制藥品質(zhì)量服務。因此，在方法建立時，不但要闡明限值的合理性，考慮技術(shù)可能達到的限值，同時還要滿足相關(guān)藥品管理法規(guī)的要求。
研究人員在建立方法的早期，一般會按照臨床建議的最大人用劑量確定一個非正式的限值，這個限值可以根據(jù)實驗室可以達到的最低檢測水平，把限值訂的相對比較嚴格，但往往由于早期的臨床劑量會比最終上市的臨床劑量高幾倍，所以嚴格的限值，可能會使得正式生產(chǎn)時很多產(chǎn)品不能通過檢查，從而造成不必要的浪費；因此參按照法規(guī)允許的最高水平，酌情確定樣品的限值。
樣品內(nèi)毒素限值的確定一般與臨床人體最大給藥劑量有關(guān)，劑量越大，單位重量或體積的內(nèi)毒素限值越低。一般按以下公式計算：內(nèi)毒素限值L=K/M。式中內(nèi)毒素限值L是以EU/ml、EU/mg或EU/u表示；K為按規(guī)定的給藥途徑，人體每公斤體重每小時最大可耐受的內(nèi)毒素劑量，以EU/（kg.h）表示，注射劑K=5EU/（kg.h），其中放射性藥品注射劑K=2.5EU/（kg.h），鞘內(nèi)用注射劑K=0.2EU/（kg.h）。一般我國人群平均體重按60kg計算，人體對細菌內(nèi)毒素的最大耐受量為300EU/h；另我國人體的平均體表面積按1.55m2計算，人體每平方米的最大耐受劑量為(300EU/h)/ 1.55m2 =（193EU/h）/ m2 。 M為人體每公斤體重每小時接受的最大給藥劑量，以ml/（kg.h）、mg/（kg.h）或u/（kg.h）表示。
內(nèi)毒素限值計算舉例（一）：A注射劑的人體最大用量為每小時1.5g，每公斤每小時體重的劑量為1.5g/60kg=0.025g/kg=25mg/kg，內(nèi)毒素限值L=K/M=(5EU/kg)/( 25mg/kg ) = 0.2EU/mg。在細菌內(nèi)毒素檢查法中，細菌內(nèi)毒素標準品和鱟試劑常常以EU/ml表示，所以在具體實驗中樣品的內(nèi)毒素的限量可以轉(zhuǎn)換為EU/ml的表示方法，可使實驗操作計算更為方便。假定產(chǎn)品A的濃度為100mg/ml（或原料藥經(jīng)溶解后的濃度為100mg/ml）, 那么，將產(chǎn)品A的限值從EU/mg轉(zhuǎn)變?yōu)镋U/ml時，內(nèi)毒素限值L= 0.2 EU/mg 100 mg/ml = 20 EU/ml。
內(nèi)毒素限值計算舉例（二）：B注射劑的臨床最大用藥劑量為1g/m2，規(guī)格為50mg/ml，內(nèi)毒素限值L=（193 EU/ m2）/（1g/m2）=193 EU/g=0.193 EU/mg，轉(zhuǎn)換為EU/ml 表示時，L = 0.193 EU/mg50 mg/ml=9.65EU/ml。
大輸液品種的限值一般定為0.5EU/ml，滅菌注射用水則定為0.25EU/ml。內(nèi)毒素限值沒有考慮到幾個藥物聯(lián)合用藥問題，但一般情況下，藥品中內(nèi)毒素的含量遠低于限值，并且藥品生產(chǎn)廠家的內(nèi)控標準嚴于注冊標準，所以藥典內(nèi)毒素限值也被稱為最大允許內(nèi)毒素濃度（Maximum allowable endotoxin concentration）。
2、樣品最大有效稀釋倍數(shù)或最小有效濃度的計算
最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)是指在所選擇的鱟試劑靈敏度條件下，對產(chǎn)品進行最大倍數(shù)的稀釋，仍能夠進行內(nèi)毒素限值的檢測，此時所允許稀釋的最大倍數(shù)。 MVD的計算公式為：當被規(guī)定的內(nèi)毒素的限值以體積表示時， MVD=內(nèi)毒素限值L（EU/ml ）/鱟試劑靈敏度（λ）；當內(nèi)毒素的限值以重量或藥品的生物活性(EU/mg或EU/u)表示時， MVD=內(nèi)毒素限值L（EU/mg 或 EU/u）×供試品溶液的濃度C/ 鱟試劑靈敏度(λ)。在凝膠法中， λ=鱟試劑的標示靈敏度（EU/ml），在濁度法或顯色法中, λ=所使用標準曲線上最低點的內(nèi)毒素濃度（EU/ml）。
最小有效濃度（MVC）是指在所選擇的鱟試劑靈敏度條件下，將產(chǎn)品稀釋到一定濃度，仍能夠進行內(nèi)毒素限值的檢測，此時所允許的最小濃度。計算MVC的一般公式為：MVC=鱟試劑靈敏度（λ）/內(nèi)毒素限值（L）。對所選定的鱟試劑靈敏度來講，MVC是一個絕對值；而MVD對特定的產(chǎn)品濃度是特異的，濃度變化時，MVD也會隨之發(fā)生變化。
3、方法學驗證試驗的預試驗
確定了樣品的內(nèi)毒素限值，考察了樣品的溶解性，并且選定了一定靈敏度的鱟試劑，此時便可以考慮進行預試驗。盡管法規(guī)中并不要求進行預試驗，但在細菌內(nèi)毒素檢查法的建立過程中，一般需要進行預試驗。預試驗的主要目的是確定不出現(xiàn)干擾的第一個樣品稀釋度，也就是不干擾濃度（non-interfering concentration, NIC），為后續(xù)的驗證試驗選擇適當?shù)臉悠废♂尪龋ɑ驖舛龋?br />
不管采用凝膠法還是光度法，預試驗都是對一系列樣品的稀釋液進行試驗，在每一個稀釋濃度，都有一組添加內(nèi)毒素的樣品和一組不添加內(nèi)毒素的樣品，添加內(nèi)毒素的濃度保持不變，而樣品濃度會逐級稀釋，但最終樣品的稀釋倍數(shù)不得超過MVD。可以采用直接把內(nèi)毒素添加到樣品溶液中，添加內(nèi)毒素的體積宜小，以免導致樣品溶液被稀釋，一般添加體積等于或小于樣品體積的10%為宜；也可以采用下述方法添加內(nèi)毒素，就是將兩倍于終濃度的內(nèi)毒素溶液與兩倍于終濃度的樣品溶液等體積混合，內(nèi)毒素和樣品溶液間相互稀釋，得到兩者所需終濃度的混合液。添加內(nèi)毒素的濃度，凝膠法為2λ；終點顯色法為4λ（這里的λ表示標準曲線上的最低點，也就是方法的檢測限）。動態(tài)顯色法則有3種選擇添加內(nèi)毒素濃度的方法，可以選擇標準曲線的中點濃度，也可以與終點比色法一樣，選擇4λ。此外，當樣品稀釋液中，內(nèi)毒素的限值小于或等于1.0EU/ml時，添加內(nèi)毒素的濃度可定為0.1-0.5EU/ml之間，當樣品稀釋液中，內(nèi)毒素的限值大于或等于1.0EU/ml時，添加內(nèi)毒素的濃度可定為1.0-5.0EU/ml之間。
對于凝膠法的結(jié)果判斷，不添加內(nèi)毒素的樣品不應該凝集，如果發(fā)生凝集說明含有內(nèi)毒素或內(nèi)毒素樣物質(zhì)；添加有內(nèi)毒素的樣品應該出現(xiàn)凝集，若沒有發(fā)生凝集表明樣品凝集反應被抑制。光度法的結(jié)果判斷標準為，測得的添加內(nèi)毒素的量應該在已知添加量的±50%范圍內(nèi)，超出范圍（多或少）表明存在增強或抑制作用。
通過預試驗結(jié)果可以確定驗證試驗中樣品的稀釋度或濃度，其選擇的基本原則包括：經(jīng)稀釋后的樣品含內(nèi)毒素的量應盡可能少，比其內(nèi)毒素限值至少少4倍，最好檢測不到內(nèi)毒素。要求驗證試驗選擇的稀釋度至少要比NIC大1-2倍，但不可超過MVD。若樣品需要多支合并進行驗證試驗，此時試驗不可采用原來的MVD，因為假定合并樣品中有一瓶存在污染，其它瓶沒有污染，污染瓶含有的內(nèi)毒素就會被其它沒有污染瓶樣品所稀釋，并低于MVD，從而檢測不到污染的樣品。因此，采用合并樣品進行試驗時，MVD應降低，這種情況下的MVD等于原來的MVD除以合并樣品的數(shù)量。
例如：假定鱟試劑的標示靈敏度λ為0.125EU/ml，樣品的MVD為100（倍）。
4、方法學驗證試驗（增強/抑制試驗）
驗證試驗在細菌內(nèi)毒素方法學的建立過程中具有十分重要的作用，主要目的是確證檢測內(nèi)毒素的方法是否受樣品的干擾。驗證試驗的特點是樣品濃度保持不變，添加內(nèi)毒素的濃度逐漸降低。在建立細菌內(nèi)毒素檢查方法中，驗證試驗前，要去除樣品可能含有的內(nèi)毒素，以確保建立方法的準確可靠。凝膠法的驗證試驗是通過在細菌內(nèi)毒素檢查用水和樣品溶液中平行進行鱟試劑標示靈敏度的復核試驗完成，試驗中要求樣品平行4管，設(shè)立樣品陰性對照管，也同樣平行4管。盡管要求添加內(nèi)毒素標準平行管數(shù)量各國不完全一致，可以2管，也可以4管，但鑒于目前國內(nèi)的具體情況，在2005年版藥典附錄的細菌內(nèi)毒素檢查法中規(guī)定是平行4管。細菌內(nèi)毒素檢查用水和樣品溶液中的反應終點濃度的對數(shù)平均值（內(nèi)毒素含量）必須在鱟試劑標示靈敏度的2倍范圍以內(nèi)，在樣品溶液和細菌內(nèi)毒素檢查用水中的反應終點濃度的對數(shù)平均值也應相互在2倍范圍之內(nèi)（2λ-0.5λ）。光度法的驗證試驗中，要求陰性對照所含有的內(nèi)毒素必須明顯低于標準內(nèi)毒素曲線中的最小濃度，陽性對照的內(nèi)毒素回收率，在扣除樣品可能含有的內(nèi)源性內(nèi)毒素后，必須在已知添加內(nèi)毒素量的50%～200%之間，添加和未添加內(nèi)毒素的樣品管數(shù)量至少要平行2管。
二、細菌內(nèi)毒素檢查方法建立時注意事項及常見問題
1、在方法建立的過程中，對方法的驗證非常重要
一個全面可靠的細菌內(nèi)毒素檢查法的方法學驗證試驗一般應注意：首先要了解產(chǎn)品的溶解度，按照適當?shù)呐R床用量確定合適的內(nèi)毒素限值，并確證產(chǎn)品對方法是否存在干擾，如果在樣品處理過程中運用了激烈的處理條件或溶劑，還應證明所采用方法不會破壞或減少樣品中細菌內(nèi)毒素含量。其次應考察樣品批與批之間的差異是否會引起方法學變異。此外，還應注意實驗中涉及到的試驗器材對方法學的影響，如：器皿的控制、鱟試劑標示靈敏度（或光度法檢測用鱟試劑的檢測限）等。最后，要確保儀器的運行狀態(tài)和對實驗過程的準確記錄。總之，只有驗證了整個實驗的每一個環(huán)節(jié)，才能保證方法學的可靠和成功。方法學驗證終究是為藥品生產(chǎn)質(zhì)量服務的，驗證本身也是一個動態(tài)的過程，是隨著生產(chǎn)工藝、環(huán)境和檢驗條件改變而變化的。方法學驗證實驗記錄，要抓住要點，將試驗關(guān)鍵步驟記錄詳細，避免驗證資料照抄藥典附錄，羅列一大堆規(guī)定，最終沒有明確的方法及可操作性。
2、內(nèi)毒素限值的確定十分關(guān)鍵
在細菌內(nèi)毒素檢查方法的建立中，計算內(nèi)毒素限值L、MVD和MVC時，需要注意最大人用劑量、產(chǎn)品規(guī)格、鱟試劑的靈敏度等重要的參數(shù)，因為計算錯誤會導致后續(xù)的所有努力均告失敗。常見的問題有：（1）臨床用藥劑量確定不正確，僅用常規(guī)用藥劑量，未考慮臨床可能的人體最大用藥劑量和給藥途徑，在限值計算公式L=K/M中，由于對K值及M值的定義模糊，使K值及M值賦值不準確，最終導致限值計算錯誤。例如，某注射劑臨床成人每次靜脈滴注給藥40～80mg，嬰兒（三個月以上）靜脈滴注給藥每次10～20mg。按成人（體重60kg）劑量計算限值為3.75EU/mg，而嬰兒體重僅為5kg左右，計算限值約為1.25EU/mg，如果不考慮臨床每公斤體重最大用藥劑量，細菌內(nèi)毒素限值就會出現(xiàn)較大的差別。（2）有的申報品種細菌內(nèi)毒素限值不是根據(jù)臨床用量計算出來，而是根據(jù)同品種熱原檢查的劑量推算出來的，造成限值錯誤。（3）有的品種細菌內(nèi)毒素限值從國外藥典抄來，沒有考慮該品種國內(nèi)上市的臨床使用劑量及中國人與國外人均體重等的差異，也造成限值確定不正確。（4）錯誤的計算日給藥劑量（一日內(nèi)多次給藥）。（5）在品種規(guī)格（濃度）發(fā)生變化時，計算MVD沒有進行調(diào)整。（6）建立方法時所用的最大給藥劑量已經(jīng)超出了臨床所用劑量等。
3、在進行干擾試驗預試驗時不干擾濃度的確定方法不正確
對預試驗的目的不理解，直接選用一個靈敏度的鱟試劑對應的MVD或MVC進行試驗，如無干擾則以該濃度為不干擾濃度，有的甚至直接選用高靈敏度的鱟試劑對應的濃度作為不干擾濃度，未找到真正的不干擾濃度，使干擾試驗失去意義。也有的申報單位僅選擇1～2個樣品濃度進行試驗，同樣使試驗缺乏完整性。
4、供試品陽性溶液配制濃度（方法）不對
在使用簡便方法配制供試品陽性溶液時，應將供試品溶液與細菌內(nèi)毒素標準品溶液等量混合、稀釋。如：配制含4倍稀釋供試品溶液的細菌內(nèi)毒素標準品溶液，應使用2倍稀釋供試品溶液和4λ細菌內(nèi)毒素標準品溶液等量混合、稀釋。常見有的配制過程中直接使用4倍稀釋供試品溶液或2λ細菌內(nèi)毒素標準品溶液濃度等量混合，造成配制的供試品陽性溶液中細菌內(nèi)毒素標準品或供試品濃度低一倍。
5、僅使用一個廠家的鱟試劑或一個批號的樣品進行干擾試驗，沒有足夠的代表性
2005年版藥典明確規(guī)定細菌內(nèi)毒素檢查進行干擾試驗時，應同時使用兩個以上廠家生產(chǎn)的鱟試劑對至少三個批號的樣品進行試驗，但有的申報單位僅用一個廠家的鱟試劑或僅對一個批號的樣品進行試驗。因為大部分注冊藥品其生產(chǎn)工藝、所使用的敷料等均不是很穩(wěn)定，不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑其抗干擾能力也不盡相同，因此僅用一個廠家的鱟試劑或僅對一個批號的樣品進行干擾試驗，沒有足夠的代表性，確定的不干擾濃度可能在后續(xù)的試驗中不準確。
6、錯誤認為一定要按最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）或最小有效濃度（MVC）進行試驗
實際上，有的樣品濃度很高也不干擾鱟試劑與內(nèi)毒素的凝集反應，這種情況下，只要樣品內(nèi)毒素含量合格，可以在MVD范圍之內(nèi)，即小于MVD的倍數(shù)下進行試驗。又如對樣品進行檢查時，也可以先用原液（預試驗時原液無干擾）進行試驗，如果內(nèi)毒素檢查也能合格，則不必進行稀釋，這樣做的直接好處是可以節(jié)約成本和時間，減少污染環(huán)節(jié)。如果一個樣品在小于MVD的情況下試驗時樣品陽性管有干擾，或樣品管為陽性，則可按MVD進行相對應的稀釋后重新試驗。如：某注射液，說明書中臨床靜脈給藥最大劑量為7mg/h，制劑規(guī)格為10mg/ml，計算內(nèi)毒素限值為420EU/ml，所采用鱟試劑靈敏度為0.25EU/ml，計算MVD＝1680倍。顯然內(nèi)毒素限值確定不正確（人體對細菌內(nèi)毒素的最大耐受量為300EU/h ），已超過了人體對細菌內(nèi)毒素的最大耐受量；另外選擇最大有效稀釋倍數(shù)的稀釋液進行試驗，每次實驗時要對樣品進行1680倍的稀釋，會使實驗變得繁瑣，不利于操作。
7、應嚴格執(zhí)行中國藥典2005年版細菌內(nèi)毒素檢查的有關(guān)規(guī)定
藥典規(guī)定：（1）當進行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗前，或無內(nèi)毒素檢查項品種建立內(nèi)毒素檢查法時，需進行干擾試驗；（2）當鱟試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，需重新進行干擾試驗。這就要求在提供的申報資料中應提供相關(guān)的方法學驗證資料，以證明方法的可行性及有無干擾的存在。只有嚴格按照有關(guān)要求進行了干擾試驗，并證明該條件下無干擾，才能建立新的檢查方法。有些錯誤的認為國內(nèi)或國外已有生產(chǎn)的品種，方法學驗證就可以不做，以至有些新藥、仿制藥未進行系統(tǒng)的干擾試驗
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