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| 購買進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 kjhfd.cn |
基因突變(gene mutation)是遺傳病和腫瘤發(fā)生的根本原因，檢測與遺傳病及惡 性腫瘤發(fā)生有關(guān)的突變基因(mutant gene)是分子生物學(xué)，醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)及腫瘤學(xué)研究 的熱點(diǎn)，它對闡明遺傳病和腫瘤發(fā)生的分子生物學(xué)基礎(chǔ)及其診斷和早期診斷具有重要 ＼意義，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，尤其是PCR技術(shù)的出現(xiàn)及近年來以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)， 結(jié)合傳統(tǒng)技術(shù)的突變基因分析方法為人們提供了許多快速、簡便、準(zhǔn)確的基因分析途 徑，并取得了令人矚目的成果. 基因突變是癌基因激活，抗癌基因失活及遺傳病發(fā)生的根本原因，從廣義的角度 來看，基因突變包括點(diǎn)突變，染色體突變和基因組突變?nèi)N形式，只是它仍所涉及的 范圍不同，后兩種基因突變涉及的基因較多，可通過光學(xué)顯微鏡分析細(xì)胞有絲分裂中 期的染色體而檢出.亦可在間期用標(biāo)記探針檢出，點(diǎn)突變通常的涉及的范圍較少，它 是腫癌和遺傳病發(fā)生的主要分子改變，因此，它是基因分析的主要研究內(nèi)容.不同類 型的基因突變有不同的檢測途徑，大致方法包括：應(yīng)用基因探針直接檢測；應(yīng)用PCR 技術(shù)檢測；利用探針技術(shù)進(jìn)行分析。 PCR在突變基因檢測時的應(yīng)用 利用核酸探針及Southern印跡雜交技術(shù)進(jìn)行基因突變分析時由于諸多限制難以滿 足這際工作的需要，自從PCR技術(shù)問世以來，建立于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上的突變基因檢測技 術(shù)發(fā)展迅速，它不僅能在短時間內(nèi)檢出發(fā)生突變的基因，而且即使獲得極微量的組織 亦可經(jīng)PCR擴(kuò)增而進(jìn)行中種檢測，加上PCR技術(shù)與探針雜交技術(shù)，RFLP技術(shù)及PCR直接 測序的結(jié)合，改換方法得以迅速發(fā)展和推廣，大大的促進(jìn)了遺傳病及腫瘤有關(guān)的基因 的研究進(jìn)展. 一、點(diǎn)突變的PCR直接檢出 (一)用PCR直接檢測缺失: 當(dāng)基因內(nèi)缺失時，可用已知的該基因DNA序列在缺失片段的兩側(cè)設(shè)計一對引物， 然后進(jìn)行PCR，對其產(chǎn)物行瓊糖凝膠電泳，溴乙錠染色，紫外檢測儀下檢測有無特異 性的擴(kuò)增產(chǎn)物，即可非常容易的判斷待檢稱本中有無DNA片段的缺失. 1.一對引物PCR檢測缺失如果一個基因的DNA序列已經(jīng)清楚，其缺失部位亦較為固 定，即可根據(jù)缺失發(fā)生區(qū)域的DNA序列在缺失片段的兩側(cè)合成一對合適的引物進(jìn)行PCR， 然后瓊脂糖凝膠電泳及溴乙錠染色，短波紫外燈下觀察有無特異性的擴(kuò)增片段，該方 法是檢測基因片段缺失最為快速的方法，在實際應(yīng)用中，為了避光因某些原因引起的 擴(kuò)增失敗而導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，常在反應(yīng)體系中加入一對與缺失片段無關(guān)的基因 引物，同時加以擴(kuò)增，以確定無特異性擴(kuò)增帶并非因反應(yīng)體系的原因的引起.如在應(yīng) 用PCR技術(shù)進(jìn)行X地貧Bartα基因胎兒水腫綜合征義基因缺失檢測時，常用一對引物擴(kuò) 增缺失區(qū)域，同時同一對β基因引物擴(kuò)增β基因的一個片段，然后電泳檢測.若同時 即有α和β基因的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，則說明α基因的擴(kuò)增產(chǎn)物則說明模板DNA中有α 基因的缺失，為Bart胎兒水腫綜合征. 2.多對引物的多重PCR檢測缺失：對于某些遺傳病的致病基因來說，其缺失具有明顯的異質(zhì)性，即在不同患者其缺 失片段有所不同，因而難以用一對缺失部位的引物將所有的缺失檢出，在這種情況 下，我們可設(shè)計多對引物檢測該基因的不同外顯子區(qū)域，即用同一PCR體系擴(kuò)增多個 外顯子然后用瓊糖凝膠電泳檢測有無缺失的片段，若某一特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物帶缺如， 則可判定為該片段的缺失，該檢測方法是對已知結(jié)構(gòu)基因有無缺失片段的最快速可行 的檢測途徑，目前已用于多種遺傳病基因缺的檢測.如在DMD/BMD缺失型突變的檢測 中，用23對引物分為三組進(jìn)行多重PCR可改98%的缺失得以檢出，另外還有人用9對物 進(jìn)行兩組多重PCR，大約可檢出DMD/BMD92%的缺失型突變. 3.用PCR技術(shù)進(jìn)行雜合性丟失的檢測：有報道，PCR技術(shù)尚可用于檢測雜合性丟失可采用PCR-SSCP及PCR定量技術(shù)進(jìn)行檢 測. (二)單個堿量置換的PCR直接檢出 1.直接檢測限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)的變化-PCR產(chǎn)物酶解分析 PCR產(chǎn)物的酶解分析，主要用于檢測可引起酶切位點(diǎn)改變--包括所增加的酶切位 點(diǎn)及原有的酶切點(diǎn)消失的單堿是量置換性點(diǎn)突變.當(dāng)某一點(diǎn)突變引起DNA片段中酶切位 點(diǎn)發(fā)生改變時，則可用酶切位點(diǎn)兩側(cè)的引物擴(kuò)增一含該切點(diǎn)的DNA片段，然后用相應(yīng) 的內(nèi)切酶進(jìn)行處理，電泳檢測，與正常的無改變的段進(jìn)行對片分析即可確定有無酶切 位點(diǎn)的改變.比如狀細(xì)胞貧血的發(fā)生即是由一酶切位點(diǎn)的改變的改，正常情況下靶DNA 的擴(kuò)增產(chǎn)物為294bp，經(jīng)OxaNI消化后產(chǎn)生191bp和103bp二個片段，但鐮狀細(xì)胞貧血的 突變使該切點(diǎn)消失，OxaNI消化后仍為294bp的片段，而雜合子則是有294、191和103 三個片段。用引方法檢測突變快速可簡便，但必須在突變點(diǎn)涉及到限制性內(nèi)切酶切關(guān) 并引起進(jìn)次復(fù)時不能因此方法檢測，因此其應(yīng)用受到限制，反能檢出點(diǎn)突變的極少一 部分. 2.3'特異PCR，擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)及等位特異PCR. 以上三種方法結(jié)構(gòu)是基于以下機(jī)理，只是不同作者的采用的名河差別而異. 在PCR擴(kuò)增時，引物的延伸是從其3'未端開始的，而這種延伸的進(jìn)行要求引物3'端 的堿基與模板需完全配對，只有這樣引物才能延伸，擴(kuò)增才得以進(jìn)行下去而得到預(yù)期 的擴(kuò)增產(chǎn)物，若引物3'端與模板不能配對，則引物的延伸即阻斷，不能得到相對應(yīng)的 擴(kuò)增產(chǎn)物，基于以上事實，可利用3'端含突變堿基的引物來檢測靶DNA中有無相應(yīng)的 突變位點(diǎn)，此即3'特異PCR，擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)及等位特異PCR.該反應(yīng)系統(tǒng)包含兩個 PCR擴(kuò)增反應(yīng)，有兩對引物但它們的3'端有差異，一為正常引物，另一為3'端編食突 變的引物，正常引物只與正常模板互解，PCR時擴(kuò)增相應(yīng)的產(chǎn)物，而食突變的引物只 與突變的模板附擴(kuò)增出相應(yīng)的產(chǎn)物.擴(kuò)增完成后可直接同瓊脂糖電泳技術(shù)檢測分析結(jié) 果。利用該系統(tǒng)進(jìn)行基因突變檢測時不僅能檢出突變的純合子，而且能檢出雜合子個 體，在這種情況下，同一個體的DNA模板利用突變引物和正常引物均能引發(fā)擴(kuò)增反應(yīng). 尚可利用多對突變引物和正常引物進(jìn)行多重3'-特異PCR，可攻DNA分子上的多位點(diǎn)變 化的鑒定準(zhǔn)確快速，簡便。 3.PCR直接測序 DNA序列分析是檢測基因突變最直接最可信的方法，它不僅可確定突變的部隊， 而且還可確定突變的性質(zhì).PCR直接測序是指對PCR產(chǎn)物進(jìn)行的直接序列分析，而不是 家傳的測序技術(shù)先將DNA待測片段克隆于測序載體上，這不僅大大的簡化了操用步 驟，節(jié)省大量的人力和物力，而且可實現(xiàn)自動化操用，加之新的熒光檢測技術(shù)的應(yīng) 用，使測序的效率大大提高. 采用PCR循環(huán)直接測序時，應(yīng)首先將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為單鏈測序模板，目前常用的 轉(zhuǎn)化方法為不對稱PCR，即在反應(yīng)體系中引物濃度的差異來形成單鏈DNA，通常側(cè)引物 的濃度為100∶1.當(dāng)某一引物被耗盡后，另一引物擴(kuò)增的片段即為單鏈然后即可用于 測序，此外，獲得單鏈DNA還有磁珠俘獲法，外切酶消化法及Genomic amplification with transcript sequeucing法(簡稱GAWTS法).PCR直接測序的最新發(fā)展是將雙脫氧 絡(luò)子技術(shù)與PCR技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行循環(huán)測序，在PCR反應(yīng)體系中同時將ddNTP加入，并利 用同位素或熒光素標(biāo)記的引物引導(dǎo)擴(kuò)增后，得模板的擴(kuò)增與測序同時進(jìn)行，其特異在 于使用的模板量小且不需分離單鏈. 應(yīng)用PCR測序有以下優(yōu)點(diǎn): (1)附模板的要求，模板需要量小. (2)方法簡便，操作易于標(biāo)準(zhǔn)化，自動化. (3)測序效率高，準(zhǔn)確，在短時間即可完成. 4.PCR-寡核苷酸探針斑點(diǎn)雜交(PCR-ASb) 如果一個基因的突變部位，性質(zhì)經(jīng)測序分析已經(jīng)闡明，即可用該方法直接檢測突 變.該方法的原理即利用人工合成的寡核苷酸片段(一般為19n+)作為探針，與經(jīng)PCR擴(kuò) 增獲得的靶DNA進(jìn)行雜交，在嚴(yán)格控制雜交條件的前提下，通過斑點(diǎn)雜交式其它類型 的雜交來檢測PCR產(chǎn)物中有無豐應(yīng)突變，即探針與靶DNA片段之間只要有一個堿基不相 互配對或錯記，就能檢出. (1)探針，探針一般合成兩個，一個為正常序列，另一含有突變位點(diǎn)，前者與正 常靶DNA完全互解，后地只與突變DNA互補(bǔ)，一般長充為19bt.該探針稱之為等位特異 寡核苷酸探針(allele specific oligo nucleotide probe，ASO探針). (2)雜交類型，PCR技術(shù)的出現(xiàn)，從根本上解決了靶DNA的來源問題，使人們能在 很短的時間內(nèi)獲足夠量的靶DNA，傳統(tǒng)的PCR-ASO技術(shù)主要是將PCR，占物固定于雜交 膜上，然用不同的標(biāo)記探針檢測，亦有將已標(biāo)記好的探針預(yù)先固定于雜交膜上，再使 之與PCR產(chǎn)物結(jié)合，檢測有無完全互補(bǔ)的DNA產(chǎn)物. (3)探針的標(biāo)記，最先應(yīng)用的標(biāo)記物為放射性物質(zhì)有32P，34S，但由于其來源， 半衰期及放射性危害不能普遍應(yīng)用.PCR技術(shù)的引進(jìn)使可在短時間內(nèi)獲得足夠量的靶 DNA片段，因而對探針的要求亦有的降低，因非同位素標(biāo)記的探針亦可獲非常滿意的 結(jié)果，它不僅使ASO探針使用起來受加快是簡便，而且無同位素半衰期的限制，操作 亦受安全，適合于臨床應(yīng)用.目前已用PKU，β地貧雜的基因突變檢測. 二、用PCR技術(shù)快速篩查突變基因 前邊所述及的方法均可直接檢出突變部位，而其前提則是突變的性質(zhì)和部位必須 清楚，但在許多情況下，基因突變的位點(diǎn)不固定，而且性質(zhì)亦不是非常清楚，因此就 需要用一些快速簡便的篩查方法以確定檢材中有無基因突變，近年來，以PCR技術(shù)為 基礎(chǔ)建立起來的突變快速篩查技術(shù)已普遍應(yīng)用于腫癌及遺傳病基因突變的檢測. (一)PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-single-strand conformation polymorphism，SSCP) PCR-SSCP是近年來發(fā)展起來的一種分析突變基因的方法，由于該方法對檢測基因 的單個堿量置換和某一片段DNA突變位點(diǎn)的篩查提供了有效而快速的手段，現(xiàn)已廣泛 應(yīng)用于遺傳及惡性腫癌基因突變的分析. 1.PCR-SSCP的原理 PCR-SSCP于1989年首先報道，該方法的原理是基于序列不同的DNA單鏈片段，其 空間構(gòu)象亦有所不同，當(dāng)其在非變性聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳時，其泳的位置亦發(fā) 生變化而表現(xiàn)出不同序列單鏈其電泳遷頻率的差異，從而據(jù)引判斷有無突變存在.對 于一段DNA來說，其單鏈具有特定的空間構(gòu)象，這種空間構(gòu)象的形成與該段DNA的堿基 序列有關(guān)，當(dāng)這段DNA發(fā)生突變，基堿基序列亦發(fā)生相應(yīng)的變化，空間相象亦隨之改 變，研究發(fā)現(xiàn)，不同空間構(gòu)象的DNA單鏈在中性聚丙烯酰胺凝膠電泳時的遷效率有所 不同，這樣對于同一段單鏈DNA來說，這種空間構(gòu)象的變化及電泳遷移的改變即能說 明其有突變的發(fā)生因此，可用經(jīng)PCR擴(kuò)增的DNA片段經(jīng)變性成單鏈然后在中性膠中電 泳，即可檢出有無突變. 2.PCR-SSCP是檢測基因中點(diǎn)突變的一種快速而簡便的方法，可用于多個標(biāo)本的篩 查，應(yīng)用時應(yīng)注意以下問題. (1)敏感性:PCR-SSCP對小于300bp的DNA片段敏感性達(dá)90-99%，一般認(rèn)為隨著DNA 片段的增大，其敏感性亦相應(yīng)的降低，多數(shù)報道認(rèn)為的檢測的擴(kuò)增片段以100-200nt 最為敏感，但近來的報道發(fā)現(xiàn)，175-345nt范圍內(nèi)進(jìn)行PCR-SSCP靈敏度無明顯變化， 亦有人用多重SSCP(multiple SSCP)500nt的單鏈DNA點(diǎn)突變亦可檢出. (2)膠的濃度與厚度，一般濃度為5-6%，需要強(qiáng)調(diào)的是丙烯酰胺與雙酰酰胺間的 比例一般為40∶1或70∶1.膠的厚度應(yīng)小于1mm. (3)甘油濃度:在室溫條件下，在凝膠中加入少量甘油(5%-10%)可獲滿意效果，在 突變應(yīng)用時應(yīng)根據(jù)實驗來確定，在其它條件都固定時，對比1%、5%、10%的甘油濃度 時的檢測效果，以找出最適應(yīng)甘油濃度. (4)電泳的濃度一般通過實驗來模索最佳溫度，一般以10-15℃效果較好. 3.PCR-SSCP結(jié)果的顯示:傳統(tǒng)的PCR-SSCP電泳結(jié)果的顯示需要借助同位素標(biāo)記， 方法復(fù)雜，限帽了其推廣.近年來非同位素方法的發(fā)展得SSCP技術(shù)得以廣泛應(yīng)用，避 免了同痊素法清多不便，適合于臨床檢測的要求，非同位法有以下幾種: (1)非同位素標(biāo)記物摻入法:可同生物素或地高親標(biāo)記的三磷酸化脫氦核苷酸摻 入，然后因相應(yīng)的方法顯色，但該方法操作復(fù)雜，所需試劑故為昂貴是其缺點(diǎn). (2)SSCP銀染法，是一種簡便實用的方法經(jīng)濟(jì)，快速，可在1-2小時完成，盡管其 靈敏度故同位素方法低，但可完全滿足檢測要求，該衛(wèi)開始逐漸取代同位素顯方法. (3)EB染色法，方法，但安全性差(EB為致癌劑)，靈敏度低是其缺點(diǎn). (4)其它，尚有熒光法標(biāo)記SSCP高，雖然其高效，靈敏，自動化高，但因期需要 特殊設(shè)備，環(huán)以推廣.PCR-SSCP的出現(xiàn)及應(yīng)用，使人們對突變基因的檢測和篩查途徑 大為改觀，該方法膠的檢測出率堿置換點(diǎn)突變，而且標(biāo)本適用范圍廣，多種類型的突 變(如短核苷酸片段的括小與缺失，等均可檢出，而且還能應(yīng)RT-PCR-SSCP及mRNA-SS CP進(jìn)行分析，加上操作及技術(shù)條件易于掌握，還可適用大量標(biāo)本的篩查，因而有廣闊 的應(yīng)用前景，其缺點(diǎn)在于不能確定突變的部位和性質(zhì). (二)，變性梯度膠(DGGE)，恒定變性膠(CGGE)及溫度(TGGE)檢測基因突變. DGGE，CGGE及TGGE三種方法是基于相同的原理而設(shè)計的突變檢測方法，它仍均是 根據(jù)DNA的解鏈特性而設(shè)計.對于同一定序列組成或的DNA片段來說，它具有恒定的解 鏈溫度(Tm)，但若其序列發(fā)生改變時，Tm值亦發(fā)生改變，在含有變性因素(變性劑， 高溫)的凝膠半進(jìn)行電泳，當(dāng)其比鏈解開形成分叉時，電泳遷移的速度就會改變.Tm值 全要取決于DNA的堿基組成，序列中出現(xiàn)單堿基替換時，Tm亦發(fā)生改變，電泳遷移率 亦改變，此即DGGE，CDGE及TGGE鑒定突變的技術(shù)基礎(chǔ). 1.變性梯度凝膠電泳(denaturing gel gradient electrophoresis，DGGE) DGGE是檢測基因突變故為精確的方法，它不僅可檢測單一片段的單點(diǎn)突變，對多 點(diǎn)突變的檢測亦較容易，該方法與PCR技術(shù)相結(jié)合，使其能非常快速的對大量標(biāo)本進(jìn) 行分析. 對于一DNA片段來說，其Tam值與基堿基組或有關(guān)，當(dāng)其堿基組成發(fā)生變化時，Tm 值亦改變，因此，對于突變的片段來說，若其在一變性物質(zhì)線性梯度增加的凝膠上進(jìn) 行電泳時，隨著變性劑濃度的增加，當(dāng)這種濃度達(dá)一定值時突變的DNA片段發(fā)生解鏈 而形成分叉，其電泳遷移速度變慢.因此突變的DNA片段與正常的DNA片段電泳的遷移 位置有差別，研究證明DGGE可檢出任何糞型的單堿基取代，如果將突變型與正常的 DNA片段形成異源雙鏈時，其敏感性大大提高. 2.恒定變性膠電泳(Constant deratarared gel electrophoresis CDGE) CDGE是DGGE基礎(chǔ)上發(fā)展起來的基因突變檢測技術(shù)，亦是利用突變基因與正?；?片段間Tm值的差異來檢測突變的方法，該方法與DGGE的區(qū)別在于聚丙烯酰胺中的含的 變性劑濃度相當(dāng)于含突變基因片段的Tm值，而且濃度恒定，而不是線性遞增.為了提 高DGGE和CDGE的檢測敏感性，通常在一側(cè)引物的5'端設(shè)計一含GC的區(qū)域(GC-ClampGC 鉗)，避免了DNA的完全解鏈，從而提高了突變的檢出率，可達(dá)100%. 3.溫度梯度凝膠電泳(Temperature gradient gel electrophoresis TGGE) 該方法是將PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物量一中性聚丙烯酰胺凝膠上，在一溫度線性梯度上升 的電場中進(jìn)行電泳，當(dāng)DNA雙鏈到達(dá)其Tm時，雙鏈解開，形成分叉，而影響電泳遷移 率，突變的擴(kuò)增產(chǎn)物其Tm值與野先型有明顯不同，因而有不同的解鏈區(qū)，從而造成電 泳遷移效率的差別，據(jù)此可判斷檢材中DNA有無突變. (六)異源雙鏈 在同一擴(kuò)增體系中，若同時含有正常模板和突變型模板時，隨著PCR的循環(huán)進(jìn) 行，野生型基因片段和突變型片段均可擴(kuò)增，并形成了異循雙鏈，由于異源雙鏈中配 區(qū)的出現(xiàn)，因而其它間構(gòu)型亦發(fā)生改變，這機(jī)型上的差別即形成電泳圖譜上的差異， 這種方法適合于較小DNA片段的分析，一般在300bp以下，其敏感性與SSCP相似，該技 術(shù)簡便，適用于快速的突變檢出，已用于多種遺傳病基因突變的研究. 除上述的幾種以PCR為基礎(chǔ)的突變檢出技術(shù)外，還有錯配堿基化學(xué)裂解法，PCR- 產(chǎn)物的RNA酶檢出法及引物競爭法用于基因突變的檢出，尤其是錯配堿基化學(xué)裂解和 PCR-RNore裂解對突變的檢測仍是10前廣泛應(yīng)用的突變檢出技術(shù)，化學(xué)裂解法以期敏 感性高，檢測片段長而應(yīng)用更為廣泛. 總之，以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)建立的基因突變檢測技術(shù)有多種，而且各有其優(yōu)缺點(diǎn)， 但目前較為廣泛應(yīng)用的為PCR-SSCP，PCR-ASO及PCR循環(huán)直接測序，隨著新方法的不斷 出現(xiàn)，將會大大的促進(jìn)基因突變的研究. |
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