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| 購買進口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 kjhfd.cn |
自1987年秋以來，PCR技術(shù)的應(yīng)用開創(chuàng)性地推動了產(chǎn)前單基因缺陷者及攜帶者的 診斷。目前PCR還不能用于診斷所有已知缺陷疾病，但極大地擴大了實驗診斷學家對 診斷方法的選擇。JohnHopkins大學的研究人員表明，在診斷基因缺陷疾病方面PCR技 術(shù)具有快速、準確、操作靈活等特點。每項進展的實例在以后描述。在1987年10月 前，我們用Southern印跡法產(chǎn)前診斷鐮刀紅細胞貧血癥通常需要兩周或更長時間，而 1987年10月以后，應(yīng)用PCR只需2-4天。在1987年以前，幾乎所有的β－地中海貧血癥 的產(chǎn)前診斷都是通過檢測在β－珠蛋白簇中連鎖DNA的多態(tài)間接完成的，一般需要2-4 周。1987年10月以后，用PCR擴增β－珠蛋白基因區(qū)后，直接檢測致病突變即可完成 β－地中海貧血癥的產(chǎn)前診斷。這個方法既增加了準確性，又縮短了時間，一般只需 一周時間。該項改進技術(shù)的作用，（1）如果我們不能確定在父母雙方中β－地中海 貧血的突變位置，我們還可以在1、2天之內(nèi)研究β－珠蛋白基因簇中DNA的多態(tài)性； （2）通過比較母親與胎兒DNA序列差別來判斷母親傳染的程度。這只是說明PCR對基 因診斷意味著什么的幾個例子。以下我們舉幾個特例具體說明PCR技術(shù)的應(yīng)用： ?。?）通過擴增產(chǎn)物的打點雜交或限制性內(nèi)切酶酶解方法確定已知的點突變； ?。?）通過對擴增產(chǎn)物直接測序來發(fā)現(xiàn)已知或未知的突變； ?。?）通過改變PCR擴增產(chǎn)物的大小或產(chǎn)物不能特異擴增來發(fā)現(xiàn)異常缺失； （4）通過對DNA多態(tài)性研究來間接診斷致病突變。最后，還將討論PCR技術(shù)的技 術(shù)性難點、重要控制條件及局限性。 產(chǎn)前基因診斷基礎(chǔ)知識 產(chǎn)前基因診斷是逐步發(fā)展起來的，而且在不斷完善。1978年Kan和Dozy提出應(yīng)用 與β－蛋白基因連鎖的DNA多態(tài)性來間接診斷鐮狀紅細胞貧血。此種診斷需要進行家 族性研究，以確定父母雙方的多態(tài)性等位基因類型，此等位基因型是用正常β－珠蛋 白基因及鐮狀紅胞β－珠蛋白基因探知的。家族被調(diào)查成員包括夫婦倆的孩子，如沒 有孩子，則調(diào)查夫婦雙方的父母。到1982年，通過利用MstⅡ限制性內(nèi)切酶方法可以 直接產(chǎn)前診斷是否有鐮狀紅細胞貧血，因為內(nèi)切酶MstⅡ及其同功酶Cv嗷螄xnNⅠ不能 在突變位點降解鐮狀β－珠蛋白基因而可在此位點降解正常βA－珠蛋白基因。這種 改進不需家族調(diào)查，就可更準確地進行鐮狀貧血病的產(chǎn)前診斷。正是這種改進法，使 直接而簡便地確定致病突變成為可能，這也是我們在所有基因診斷研究中所力求的。 單基因缺陷的診斷是通過對連鎖DNA多態(tài)性研究及家族研究而確定的。到1988年 底，我們利用這種方法診斷了一些患Duchenne肌營養(yǎng)不良癥病人、大多數(shù)甲型和乙型 血友病人、所有囊性纖維變性病人及Huntington氏病、神經(jīng)性纖維瘤和成人多囊腎病 人。應(yīng)用這種技術(shù)同時直接發(fā)現(xiàn)了鐮狀紅細胞貧血、β－地中海貧血、α地中海貧血 有大多數(shù)Duchenne肌營不良癥、部分甲型血友病和成視網(wǎng)膜細胞瘤病人的致病突變。 幾乎所有這些病例中，由于重要的DNA序列是已知的，所以PCR技術(shù)在產(chǎn)前診斷、癥發(fā) 前診斷及攜帶者發(fā)現(xiàn)等方面具有非常重要的價值。 應(yīng)用PCR技術(shù)直接發(fā)現(xiàn)點突變 在點突變診斷中，繼PCR技術(shù)之后可用三種技術(shù)一打點雜交、酶切分析及直接測 序。John Hopkins大學研究人員應(yīng)用以下幾步來診斷鐮狀紅細胞貧血：（1）將人絨 毛膜樣品（CVS）或羊水中得到的胚細胞在2MNaCl，0.1NNaOH溶液中煮沸。（2）應(yīng)用 PCR技術(shù)在β珠蛋白基因5'末端擴增一個725bp區(qū)，用30個循環(huán)，72℃鏈延伸120''。 （3）用CvnI酶消化725bp擴增產(chǎn)物。（4）降解的產(chǎn)物進行電泳。（5）EB染色。（6） 紫外燈下觀察DNA片段，并拍照。 在反應(yīng)中選擇使擴增產(chǎn)物含有兩固定CvnI位點的引物。因此，酶解產(chǎn)物至少應(yīng)可 見三條帶。每個鐮狀紅細胞的β珠蛋白基因含有一個381bp帶，而正常βA珠蛋白基因 經(jīng)酶結(jié)果已積累了大量信息，所以我們傾向選用限制性內(nèi)切酶法消化經(jīng)PCR擴增的產(chǎn) 物，而不是利用特異寡核苷酸探針經(jīng)打點雜交來診斷βS突變位置的β突變位置。然 而，這種方法的的局限性（也是Southern雜交的局限性）是不能顯示包括第六密碼子 即βS突變位置的β珠蛋白基因的缺失。因此，一個雜合子個體（含一個βS珠蛋白基 因，及一個基因缺失）與患鐮刀狀紅細胞貧血病人（含兩個βs珠蛋白基因）酶切片 段的條帶圖形是一樣的。所以，在診斷這類病人時，會遇到一些困難，最后只有調(diào)查 其雙親才能確診。如果雙親都是βaβs基因型，這個人可確診為鐮狀紅細胞貧血癥。 如果雙親中一個一是βa型，另一個是βaβs基因型，此人診斷為βs雜合子基因型且 βs珠蛋白基因含一個缺失。由于突變引起的疾病具有一定特征，所以，理論上直接 確診β地中海貧血是可能的。發(fā)生地中海貧血癥的高危人群為地中海人、中東人、亞 州印度人、中國人和黑人。到1988年底，已知引起地中海貧血的突變有60多種，引起 地中海貧血的99％等位基因特征是已知的，其余的等位基因很少或存在于易患者很少 的種族中。因為每種人群有自己的β地中海貧血突變譜，一般情況下，4-6對等位基 因在任一特定種族的β地中海貧血基因中占99％以上，因此，使確定易患β地中海貧 血的夫婦二人的致病突變簡單化。
通常無子女的配偶雙方更應(yīng)檢查，因為他們的紅細胞比積及血紅蛋白A2含量篩選 測試似乎具有β地中海貧血特征。其方法是檢查夫妻雙方是否含有所在人群中覺的等 位基因型。自1987年9月以來，在不利用DNA多態(tài)性和Southern分析方法情況下，在各 種簇中我們在產(chǎn)前明確診斷了80例地中海貧血病人，所有這些診斷是通過直接確定夫 婦及其胎兒的突變獲得的，此方法通常需要把打點雜交與限制性內(nèi)切酶分析法結(jié)合起 來。需進行基因組序列分析的情況很少。60種地中海貧血的等位基因突變型的一半以 上類型可以通過擴增產(chǎn)物酶切分析方法查明。對于地中海地區(qū)的夫婦，通過這種方法 可以分析無意義密碼39，移碼6，IVS-2，nt-1，IVS-2，nt745，IVS-1，nt-6及-87。其 余在地中海人中常見的突變，IVS-1，nt110，IVS-1，ntl和移碼8全由打點雜交發(fā)現(xiàn)。 在打點雜交分析中，5-19％的擴增產(chǎn)物（通常為β珠蛋白基因從5'起的一半。片 段長度為725bp）在硝酸纖維膜上點兩次。對個體斑點通常是對照，以確定每個斑點 代表的是陽性結(jié)果，還是陰性結(jié)果。斑點與32p標記寡核苷酸（19mer或20mer）或非 同位素標記探針雜交，探針的序列對所研究的突變是特異性的。另一組同的斑點與正 常β珠蛋白基因序列雜交，以確定所定的DNA量足夠產(chǎn)生陽性信號。如果用突變探針 雜交結(jié)果為陰性而正常探針雜交結(jié)果為陽性，那么，我們可斷定病人沒有攜帶分析中 特寫的突變基因。如果兩種探針雜交結(jié)果均為陽性，病人為雜合人，病人攜帶有所研 究的突變基因；如果突變探針雜交顯示陽性結(jié)果，而正常探針雜交為陰性，病人為所 分析的突變基因純合子。 斑點表示ASO探針與用于β地中海貧血產(chǎn)前診斷的β珠蛋白DNA擴增產(chǎn)物的雜交 情況。利用ASO突變探針與擴增DNA雜交，表明雙親攜帶無意義密碼子39的突變。對 照樣品，一般用于洗滌特異性監(jiān)測，它們點在從上數(shù)第3，第4點，分別代表正常β珠 蛋白純合子及無意密碼39β地中海貧血等位基因純合子DNA的擴增產(chǎn)物。上夫婦已有 孩子的DNA擴增產(chǎn)物只與突變的ASO雜交，而他們胎兒的擴增DNA既與突變ASO雜 交，也與正常ASO雜交，說明胎兒是β地中海貧血攜帶者。 在夫妻雙方的DNA均經(jīng)過是否含有在其種族中普遍存在的突變等位基因型的檢查 后，極個別的情況下，夫婦中有一個人的β地中海貧血癥等位基因型仍是未知的。在 這點上，需對β珠蛋白基因上重要區(qū)段測序以確定未知的致病突變類型。用T7DNA聚 合酶（測序酶）在DNA基因組擴增區(qū)上測序。這些區(qū)域DNA包括（1）啟動子，外顯 子－1，內(nèi)含子－1，外顯子2及內(nèi)含子－2的5'端90個核苷酸；（2）內(nèi)含子2的3'端300 個核苷酸和外顯子3。用此方法可以確定幾乎所有未知突變類型，但至少有兩個例 子，在輕度β是中海貧血癥等位基因攜帶者的β珠蛋白基因或5'和3'關(guān)鍵區(qū)中未找到 突變。在我們的工作中，通過對PCR擴增的β珠蛋白基因直接測序發(fā)現(xiàn)了7種新的等 位基因類型。Huisman在我們沒研究的其他種族中也發(fā)現(xiàn)了一些新的等位基因。 采用PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)缺失 利用缺失的5'和3'端引物可以檢測出中等大小片段的缺失（1-1.5bp），在印度 人群中，患β地中海貧血病人的β珠蛋白基因中通常存在一個619bp缺失片段。我們 發(fā)現(xiàn)在DNA中用引物可擴增產(chǎn)生1215bp片段，而當有619bp片段，可認為是缺失雜合 子。 缺失也可通過在PCR復(fù)合反應(yīng)中沒有缺失基因的產(chǎn)物而其它基因產(chǎn)物仍然存在來 測出。Chehab等自先用此法證明了在α珠蛋白產(chǎn)物表明，純合缺失片段區(qū)至少有一個 α珠蛋白引物序列。最近，Chamberlain把這個方法用于患Duchenne肌營養(yǎng)不良（NMD） 的男性的營養(yǎng)不良基因的研究。DMD是一種X性連鎖嚴重的、早發(fā)肌營養(yǎng)不良癥，主要 原因是由于營養(yǎng)不良基因中缺失大約2000bp片段造成的。在肌營養(yǎng)不良基因中，大約 60-70％DMD等位基因發(fā)生大片段缺失。Chamberlain等已經(jīng)測出重要區(qū)的DNA序列并制 備了對這些序列及其它已知序列特異的引物。他們找出了用9種引物對進行PCR反應(yīng)， 以擴增營養(yǎng)不良基因所在的9個不同區(qū)段，在這些區(qū)段上有80-90％的缺失已知。用這 些引物對，確定了許多缺失（見第十五章），這些缺失由用營養(yǎng)不良cDNA探針進行的 Southern印跡法證實。這種用PCR復(fù)合反應(yīng)進行缺失分析的方法可用于快速普查，并 可在50%的男性病人中發(fā)現(xiàn)突變。其作家族成員還需要進行cDNA探針分析以發(fā)現(xiàn)有無 其它缺失，以及用DNA多態(tài)性分析檢測家族內(nèi)其他患者的情況。 在用復(fù)合PCR技術(shù)探測缺失方面也有兩個局限性。首先，無論何時當我們研究缺 失片段時會擔心擴增不出的片段實際上在基因組DNA上存在，只是由于其它未知的原 因而沒擴增出來。我們采用此方法，在我們實驗室曾遇到過，3個引物在某些正常樣 品中擴增出3種產(chǎn)物，而在其它的正常樣品中3個引物只擴增出2個產(chǎn)物。因此，在解 釋9個引物中有8個或7個引物有擴增產(chǎn)物的實驗結(jié)果時要非常謹慎。這意味著要進行 重復(fù)實驗才能確證基因缺失的存在。此外，在臨床應(yīng)用復(fù)合PCR技術(shù)的早期，可采用 相應(yīng)的營養(yǎng)不良cDNA探針進行Southern印跡法證實缺失片段。分析易患DMD的家族 時，分析攜帶者是重要的，目前可采用營養(yǎng)不良cDNA探針進行定量Southern印跡法來 診斷攜帶者。 應(yīng)用PCR技術(shù)檢測連鎖性DNA多態(tài)性 在目的基因未被分離出來的情況下，在大多數(shù)產(chǎn)前診斷、攜帶者的發(fā)現(xiàn)及癥發(fā)前 診斷中所使用的基因診斷仍可完成。至1988年底，囊性纖維變性病、Huntington氏 病、神經(jīng)纖維瘤等診斷就屬上述情況。這些病例的基因診斷完全依賴于用與疾病位點 連鎖的DNA多態(tài)性(RFLPs）對患者家族聽致病基因進行追蹤來完成。當重要DNA多態(tài)性 序列周圍的DNA序列已知時，應(yīng)用PCR方法可以很簡便地知道重析內(nèi)切酶位點的存在及 丟失。 Mullis和Faloona首先用DNA多態(tài)性PCR分析法診斷鐮狀紅細胞貧血，Kogan等用此 法診斷甲型血友病，但文獻表明應(yīng)用PCR分析多態(tài)性位點周圍序列有潛在的局限性， 因多態(tài)性位點XbaI可以在同一基因組的其它部位復(fù)制。在短擴增片段及擴增Ⅷ：C因 子基因的目的區(qū)及第二區(qū)的引物上無其它XbaI位點。對帶有Ⅷ：C因子的男性DNA的 XbaI位點分析表明，除了多態(tài)性XbaI位點被切割產(chǎn)生的兩上小片段外，不被切割的片 段由第二區(qū)產(chǎn)生。具有＋／－多態(tài)性位點基因型的女性相區(qū)別。當應(yīng)用Southern印跡 法時，就可以區(qū)分之，在Southern印跡法中，所分析的片段比從Ⅷ：C因子基因上復(fù) 制出的XbaI區(qū)大，此XbaI區(qū)大小與第二區(qū)不同 已報道過應(yīng)用PCRDNA多態(tài)性分析法進行囊性纖維變性的產(chǎn)前診斷及Huntington氏 癥的癥發(fā)前診斷及產(chǎn)前診斷。另外，我們可以利用5個限制性內(nèi)切酶多態(tài)性PCR法，對 β珠蛋白基因簇進行單體分類。如果直接法診斷β地中海貧血和鐮狀紅細胞貧血遇到 困難，可采用PCR分析家族成員單體型而間接、快速地進行產(chǎn)前診斷。因此，PCR被用 于許多單基因病變的臨床診斷，如鐮狀紅細胞貧血、地中海貧血、甲型血友病、 Duchenne肌營養(yǎng)不良癥、囊性纖維變性和Huntington氏癥。 技術(shù)難點 許多難點在開始已提到。既使其它引物能成功地擴增，一個引物對可能在同樣的 DNA模板上卻無法擴增。這就給應(yīng)用復(fù)合PCR反應(yīng)法準確地分析片段缺失帶來困難。 由于引物緩沖液被基因組DNA污染，可導(dǎo)致判斷上的失誤或極大的錯誤，因在用 被污染的引物所做的所有擴增樣品中可能會觀察到相同的結(jié)果。因此在取樣時應(yīng)十分 謹慎，應(yīng)把PCR所用的玻璃及塑料器皿與一般實驗所用的分開，偶爾，不知什么原因 造成某個基因組DNA的擴增失敗。常見的是因為在DNA提取過程中造成的污染?？赏ㄟ^ 減少基因組解DNA樣品也造成擴增失敗，這時，需重新提取DNA。 展望 我們預(yù)期PCR將能用于普查攜帶者，尤其是下列一些疾病、在一個或多個種簇中 發(fā)病率很高的疾病、患者具有典型癥狀的疾病以及那些有關(guān)的基因已知的疾病和導(dǎo)致 所有突變等位基因的突變已知的疾病。應(yīng)用DNA分析法來普查鐮狀紅細胞貧血β地中 海貧血攜者是可能的，但非DNA法仍比任何基因檢測都兼且簡便。應(yīng)用PC技術(shù)在Ashk- enazi猶太人群中普查Tay-Sachs（家族黑蒙性白癡）等位基因攜帶者，具有很大可能 性。近來的研究表明在氨基已糖酶Aα鏈基因的兩個等位缺失可能是導(dǎo)致所有Ashken- azi人的Tay-Sachs病基因攜帶者進行普查。在北歐人群中，大約50％苯丙酮尿癥（PKU ）等位基因已被定性。除了現(xiàn)存基因分析，沒有其它方法可以檢出 PKU攜帶者。因有家族病史而非常有可能是攜帶者檢查，當PKU的等位基因完全清楚 后，這種檢查是可能的。 當找到CF（囊性纖維變性）基因及確定引起CF基因的等位突變特征后就可用PCR 技術(shù)普查攜帶者了。如果等位基因數(shù)目小（小于10）且沒有簡單的生化檢測法（以蛋 白缺失為原理）可以發(fā)現(xiàn)攜帶者類型時，利用基因技術(shù)普查攜帶者是可行的，利用 PCR技術(shù)普查人群中CF攜帶者來確定該病在人群中的發(fā)生率也是可行的。 利用PCR技術(shù)診斷單基因疾病的可能性極大，利用連鎖DNA多態(tài)性PCR診斷分析法 可對神經(jīng)纖維瘤、成視網(wǎng)膜細胞瘤、成人多發(fā)性多囊腎癥及強直性肌營養(yǎng)不良進行診 斷。通過對各種致病基因經(jīng)PCR擴增后用密度梯凝膠電泳進行外顯了序列分析，如甲 型血友病基因Ⅷ：C因子的外顯子，可直接對大多數(shù)患者進行突變等位基因的直接診 斷。一項新技術(shù)使基因診斷發(fā)生了重大改革，此技術(shù)是將帶有寡聚－T尾巴的寡核苷 酸固定在濾紙上，使其與生物素化的患者DNA目的區(qū)段的PCR產(chǎn)物雜交。此技術(shù)將簡化 一個個體基因組中5-10個或更多等位基因的分析，象現(xiàn)在的β地中海貧血癥等位基 因、鐮狀紅細胞貧血癥等位基因、PKU等位基因、CF等位基因及Tay-Sachs等位基因等 等。一個復(fù)合PCR反應(yīng)可同時檢測一組基因。 在胚胎植入前進行遺傳特性分析因有PCR而成為可能。在分裂期從胚中取1-2個細 胞，用PCR可通過這些細胞的DNA進行基因診斷。此間胚可在體外繼續(xù)生長，然后植入 子宮。在其它種屬中，從分裂期胚中取少數(shù)細胞后再植入母體，胎兒的分化同樣正 常。因此在胚胎植入前進行基因診斷是可行的。但此方法的倫理問題是爭論的焦點， 且讓實驗檢查委員同意將在分裂期被取走少數(shù)細胞的人類胚進行植入是不可能的。 |
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