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| 購買進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 kjhfd.cn |
骨腫瘤較罕見，惡性骨腫瘤只占全身惡性腫瘤的1%，男多于女，性別比約為1.6 ∶1，均好發(fā)于10-30歲間，良性者以骨軟骨瘤最多，依次為骨巨細(xì)胞瘤、內(nèi)生軟骨瘤 等，惡性者以骨肉瘤最多，依次為軟骨肉瘤、纖維肉瘤等.骨惡性腫瘤的發(fā)生機(jī)理目 前認(rèn)為是癌基因顯性作用與抗癌基因失活的結(jié)果，是多種癌基因多階段多途徑協(xié)同作 用的結(jié)果.骨惡性腫瘤轉(zhuǎn)移涉及到腫瘤細(xì)胞自身與宿主細(xì)胞之間錯綜復(fù)雜的關(guān)系，受 多種相關(guān)基因的調(diào)控，即腫瘤的轉(zhuǎn)移與轉(zhuǎn)移基因和轉(zhuǎn)移抑制基因有關(guān)，與生長因子及 其受體的表達(dá)以及某些癌基因產(chǎn)物有關(guān).因此，通過對活化的癌基因及抗癌基因改變 的檢測，可以快速分析患者腫瘤的易感性及判斷腫瘤的預(yù)后;檢測耐藥基因的表達(dá)程 度，可為腫瘤的診治提供方案選擇的依據(jù);通過對轉(zhuǎn)移基因及轉(zhuǎn)移抑制基因的檢測， 可以判斷腫瘤有無轉(zhuǎn)移，對手術(shù)治療案提供依據(jù). PCR技術(shù)是一門新型快速診斷技術(shù)，具有敏感、特異、專一性強(qiáng)等特點，在骨腫 瘤診斷及研究方面具有其它方法難以比擬的優(yōu)越性. 一、PCR技術(shù)在骨腫瘤診斷中的應(yīng)用 骨腫瘤診斷需要解剖學(xué)、組織學(xué)和胚胎學(xué)等基礎(chǔ)知識，對病變需認(rèn)真觀察，仔細(xì) 分析，但更重要的是對臨床資料及X線所見要特別重視.骨腫瘤形態(tài)變異較大，而臨床 X線觀察較全面，病理鏡檢有一定局限性，而一些癌基因改變是與某一型骨腫瘤密切 相關(guān)，即為腫瘤特異性基因，因此在骨腫瘤診斷方面在堅持臨床、X線及病理三結(jié)合 的診斷原則基礎(chǔ)上，通過PCR技術(shù)對腫瘤特異性癌基因變化的檢測，可以更好地輔助 骨腫瘤的診斷，具有其它方法不可代替的優(yōu)越性. 1.成骨系統(tǒng)腫瘤的診斷 本系統(tǒng)中惡性腫瘤最多見的是骨肉瘤，由于骨肉瘤類型繁多，有多方向分化特 點，故形態(tài)復(fù)雜，除常見的成骨型、成軟骨型、成纖維型外，尚有較罕見的惡纖維 型、血管擴(kuò)張型、小圓細(xì)胞型，髓內(nèi)高分化型和富于巨細(xì)型的骨肉瘤.骨肉瘤雖多由 髓內(nèi)發(fā)生，但也可由骨外膜發(fā)生，向外生長形成骨表面骨肉瘤.骨表面骨肉瘤近年來 又根據(jù)其形態(tài)及惡性度的不同分成四個亞型，盡管各型有其形態(tài)特征，但在常規(guī)診斷 時還是有不少被誤診.腫瘤生物學(xué)研究表明，骨肉瘤中細(xì)胞DNA含量明顯高于正常細(xì) 胞，并具有一系列癌基因的改變，如骨肉瘤中75%的P53基因突變，mdm2、c-myc及 c-raf擴(kuò)增，TPR-met重排等. 首先，我們可以用定量PCR方法檢測細(xì)胞中DNA含量，來判斷腫瘤的良惡性，接 著，利用多重PCR或巢式PCR檢測P53、mdm2、c-raf、met等的基因改變，來確診是否 為骨肉瘤，同樣可以利用數(shù)種骨肉瘤特異的單克隆抗體，采用免疫PCR方法對骨肉瘤 進(jìn)行診斷及分型.隨著nm生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，可以利用原位PCR方法，先確定好特異性 癌基因產(chǎn)物的位置，然后在透射電鐿下動態(tài)觀察其形態(tài)及結(jié)構(gòu)，這樣可以更好地確診. 2.軟骨系統(tǒng)腫瘤的診斷 軟骨腫瘤的惡性程度除與細(xì)胞異形性有關(guān)外，和腫瘤發(fā)生部位及其體積大小亦密 切相關(guān).發(fā)生在近心端的如骨盆、肩胛等直徑大于6cm者，即使細(xì)胞異形性不太明顯， 也可能為高分化軟骨肉瘤，反之若腫瘤發(fā)生在遠(yuǎn)端，雖細(xì)胞較密集有中等程度異形 性，但一般顯示良性生物學(xué)行為，可診斷為良性腫瘤.軟骨腫瘤分類也十分復(fù)雜，根 據(jù)形態(tài)學(xué)診斷易誤診，從基因水平來診斷更符合實際情況.首先要區(qū)分是良性腫瘤還 是惡性腫瘤，運用定量PCR方法，檢測細(xì)胞中DNA含量，可以判斷良惡性.其次，要與 骨及其它組織腫瘤相鑒別.研究表明，Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、骨形成蛋白、骨鈣素、 骨連接蛋白等均為骨特異性蛋白，運用定量PCR方法，檢測相應(yīng)基因的表達(dá)程度可以 確定其組織來源，同樣也可以利用相應(yīng)的單克隆抗體，采用免疫PCR方法確定其組織 來源及分型. 3.骨惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的診斷 近幾年的研究表明，癌基因mdm2的擴(kuò)增與骨惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，mn23-H1 在轉(zhuǎn)移的骨惡性腫瘤中呈低表達(dá)，在分化良好的腫瘤中呈高表達(dá).因此，運用定量PCR 方法檢測癌基因mdm2擴(kuò)增程度，以及mn23-H1的表達(dá)程度可以判斷骨惡性腫瘤有無轉(zhuǎn) 移. 4.骨惡性腫瘤治療效果的判斷 近幾年的研究表明，微小轉(zhuǎn)移灶在骨惡性腫瘤發(fā)生后不久就存在于周圍的血液循 環(huán)中，骨腫瘤的手術(shù)治療只能解決局部問題，而微小轉(zhuǎn)移灶的清除必須依賴于放療、 化療或免疫治療，因此，檢測外周血中有無微小殘余病灶，可以判斷治療效果，并對 是否需要繼續(xù)治療提供依據(jù). 二、PCR技術(shù)在骨腫瘤研究中的應(yīng)用 1.在骨腫瘤發(fā)病機(jī)理研究中的應(yīng)用 骨惡性腫瘤是多種癌基因多階段多途徑協(xié)同作用的結(jié)果，到目前為止，發(fā)現(xiàn)與骨 惡性腫瘤密切相關(guān)的癌基因有K-ras、c-fos、proα-1、proα-2、c-sis、c-raf、 c-myc、met、mdm2，抗癌基因有Rb、P53、P16等.發(fā)現(xiàn)的癌基因已有100多個，抗癌基 因有8個，它們當(dāng)中究竟還有哪些與骨惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)，仍有待于進(jìn)一步研究. PCR技術(shù)是一門快速診斷技術(shù)，尤其是PCR相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，給分子水平的研究帶來了 一場革命.使研究的效率大大提高. ①骨惡性腫瘤中癌基因突變、缺失、重排的研究癌基因突變重排常導(dǎo)致腫瘤的發(fā) 生，因此檢測癌基因的改變對研究骨腫瘤發(fā)生機(jī)理具有重要意義.傳統(tǒng)的方法是提取 DNA，走電泳，轉(zhuǎn)移到NC膜上，再用標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，檢測缺失、重排、突變.方 法比較繁瑣，放射性同位素對人體亦有害，而PCR技術(shù)利用一對引物就可以把待檢的 DNA片段擴(kuò)增出來，再利用RFLP技術(shù)或SSCP技術(shù)就可以檢測出有無重排、缺失、突 變，既方便快速，又對人體沒有任何傷害. ②骨惡性腫瘤中癌基因擴(kuò)增與表達(dá)的研究 特異性癌基因的擴(kuò)增與高表達(dá)常導(dǎo)致骨腫瘤的發(fā)生，找出這種特異性癌基因?qū)?惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)理的研究具有重大理論意義，同時，也給臨床診斷骨腫瘤帶來特異 性指標(biāo).傳統(tǒng)的研究方法首先要提取DNA或RNA進(jìn)行紫外定量，并用尿素變性電泳鑒定 有無降解，然后再轉(zhuǎn)移或打點至NC膜上，用相應(yīng)的標(biāo)記好的探針進(jìn)行雜交，放射自顯 影，最后進(jìn)行灰度掃描來定量，這種研究方法最快也得需要二周時間，而定量PCR技 術(shù)則只需50-80ng的模板DNA或RNA，擴(kuò)增25個循環(huán)，就可以從計算機(jī)中打印出結(jié)果， 得出原始模板當(dāng)中某個癌基因的拷貝數(shù)，可以直接判斷出有無某種癌基因的擴(kuò)增與高 表達(dá).運用PCR方法篩選這種特異性癌基因，方法簡便，快速，在較短的時間內(nèi)可以完 成相當(dāng)大的工作量. ?、酃菒盒阅[瘤特異性抗原基因的篩選研究 十多年來對骨惡性腫瘤細(xì)胞株的研究表明，骨惡性腫瘤中存在一些特異性抗原與 相關(guān)性抗原，并且已經(jīng)研制成了一些特異性單克隆抗體，但是到目前為止，尚未有人 篩選出骨惡性腫瘤特異性抗原的基因，傳統(tǒng)的研究方法是首先從大量腫瘤組織中提取 腫瘤抗原，然后免疫動物，取脾臟等與雜交瘤融合，再從陽性克隆中篩選特異性的單 克隆抗體.這種單抗，運用于人體仍然可引起免疫反應(yīng)，故在九十年代開始，已進(jìn)行 人源性單抗的研制，尤其是絲狀噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)的運用，使得人源性全套抗體庫的構(gòu) 建獲得成功，避免了免疫動物等一系列繁瑣途徑.全套抗體庫的構(gòu)建首先利用mRNA.直 接反轉(zhuǎn)錄成cDNA，構(gòu)建成cDNA文庫，根據(jù)抗體可變區(qū)基因兩側(cè)序列的保守性，設(shè)計與 之結(jié)合的一對引物，以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增出抗體可變區(qū)重鏈和輕鏈基因，用接頭 DNA連接起來，再與絲狀噬菌體基因Ⅲ5'端重組，表達(dá)于噬菌體表面，然后將噬菌體 抗體文庫通過表面結(jié)合有特異性腫瘤抗原的親和柱，就可以篩選出相應(yīng)的人源性單克 隆抗體.然后對單抗進(jìn)行部分氨基酸序列分析，反推出數(shù)個寡核苷酸，以這幾個寡核 苷酸為引物，運用AP-PCR方法直接篩選出相應(yīng)的抗原基因. 2.在骨腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)理研究中的應(yīng)用 ?、賜m23-H1基因與骨惡性腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)性研究 nm23-H1基因是轉(zhuǎn)移抑制基因，它已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)移有關(guān)，但在骨腫瘤 中結(jié)果如何未見報道，作者擬對18例骨惡性腫瘤標(biāo)本運用定量PCR儀，檢測了nm23-H1 表達(dá)程度. 引物P1為:5'GGGACGCAACTGTGAGCGTACCTTC3'； 引物P2為:5'GATTGGATCCTCATTCATAGATCCAGTTCTGACC3' 利用帶有熒光信號的通用接頭把熒光信號標(biāo)記在P15'端，運用定量PCR儀，以正 常肝臟組織總RNA為模板，進(jìn)行一系列倍比稀釋，運用RT-PCR一步法直接擴(kuò)增.結(jié)果表 明，當(dāng)模板為80ng時，25個循環(huán)后，擴(kuò)增產(chǎn)物量與擴(kuò)增指數(shù)呈線性關(guān)系，因此，當(dāng)模 板采用80ng時，利用定量PCR儀可檢測出原始模板中nm23-H1拷貝數(shù)，從而可以判斷出 nm23-H1的表達(dá)程度.(研究表明，nm23-H1與骨惡性腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān))同理，可以運用定 量PCR儀進(jìn)行多種癌基因的檢測，從而篩選出與轉(zhuǎn)移相關(guān)的癌基因. ?、诠悄[瘤轉(zhuǎn)移基因的篩選研究 基因直選法是建立在分子雜交和PCR技術(shù)基礎(chǔ)上的一項基因分離技術(shù)，可以運用 于骨腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選.基本原理是利用人的基因組區(qū)做誘餌，從骨腫瘤cDNA 文庫中釣出其互補區(qū)，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，使釣出的CDNA大量擴(kuò)增，再將CDNA克隆進(jìn) 行直接測序分析，然后用定量PCR方法檢測臨床轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移標(biāo)本，看表達(dá)相差的程 度，來進(jìn)一步證實是否為骨腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因.這種方法特別適用于正常情況下表達(dá) 很低的轉(zhuǎn)錄單位相應(yīng)基因的分離.總之，PCR技術(shù)是一門非常有用的技術(shù)，掌握它可以 給基礎(chǔ)研究及臨床診斷帶來難以想象的收獲，尤其是PCR相關(guān)技術(shù)的發(fā)展給基礎(chǔ)研究 帶來了一場新的革命，PCR技術(shù)必將會獲得越來越廣泛的應(yīng)用. |
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