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DMD(Duchenne Muscular Dystrophy)和BMD(Becker Muscular Dystrophy)是一種常見的X連鎖隱性遺傳病，主要發(fā)生于男性，其發(fā)病率為1/3500活產(chǎn)男嬰，其發(fā)生的原因是Dystrophin(抗肌萎縮蛋)其固缺陷所致. 一、DMD/BMD的臨床表現(xiàn) 在臨床上DMD較BMD常見，發(fā)病早，癥狀重，正常于2-3歲即出現(xiàn)骨骼肌無力的表現(xiàn)，一般從骨盒帶肌肉無力開始而出現(xiàn)一系列的特殊癥狀:走路困難呈鴨步，出現(xiàn)Gower's征，腓腸肌進行性肥大.逐漸出現(xiàn)心肌細胞受損，約30%的小兒智能力缺陷.在12歲左右失去能力，至20歲時正常死于呼吸衰竭和心力衰竭.而BMD相對來說癥狀較輕，進展亦較慢. 二、DMD/BMD的遺傳病 (一)遺傳方式:X-連鎖隱性遺傳，發(fā)病者多為男性，其母親為致癌基因攜帶者，尚有1/3的患者為散發(fā)病例，則新生突變引起. (二)，DMD/BMD的致病基因:1.基因定位:DMD/BMD是因位于Xq21，其基因非常大約為2400Kb.2.基因結(jié)構(gòu):該基因共有79個外顯子，78個內(nèi)含子，其CDNA全長約為13974個時，編碼的肽鏈含3685aa殘基，編碼蛋白命名為dystrophine，其基本5個獨立的啟動子，在DMD基因內(nèi)還存在一些STR，已知有13個STR，其中5'端編碼區(qū)有8個，3'端編碼區(qū)有1個，44，45，49，30，50內(nèi)含子各有一個STR，是多為DNDR核心是(CA)n.等位基因數(shù)目為2-19個. 三、DMD基因的突變類型 (一)缺失與重復(fù):研究表明約65%的DMD/BMD是由于基因內(nèi)的部分缺失所致，尚有12.5%病例有基因內(nèi)重復(fù)，這種突變變有兩個高頻發(fā)生區(qū)，一個在基因的5端，另一個大致在第45～55外顯子區(qū)域，而5'端的缺失重復(fù)熱點大致在第1～7外顯子區(qū)域.缺失的范圍從1至數(shù)個外顯子，甚至整個DMD基因亦可發(fā)生缺失，啟動子區(qū)亦有缺失發(fā)生. (二)單堿量換:近年來的研究還發(fā)現(xiàn)，在DMD基因內(nèi)尚有單堿其置換，目前已發(fā)現(xiàn)的約有6種，根認為在DMD患者中由此型突變引起者占30%左右. (三)基因內(nèi)連接形成和mRNA剪接異常:以上兩種類型的突變亦在DMD人群中有抗，但因研究的病印例尚少，需要進上步的研究. 四、利用PCR技術(shù)診斷DMD的途徑 (一)用PCR技術(shù)檢測缺失型突變. 利用PCR可直接檢出DMD/BMD的缺失型突變，由于DMD/BMD發(fā)生時，其65%的患者為基因缺失所致，因此直接檢測缺失可使65%的患者得到診斷.在DMD/BMD基因的缺失中，其缺失范圍，缺失的位置具有高度異質(zhì)性，加之DMD/BMD基因較大，很難用一對引物確定其缺失部位，隨著DMD/BMD基因的克隆及其精結(jié)構(gòu)的闡明，有人開發(fā)了多時引物進行多重PCR，從而可使幾乎全部的缺失型DMD/BMD得到診斷. 1.利用6對引物擴增處于缺失熱點區(qū)域的6個外顯子，即外顯子8，16，19，44，45和48，再加上外顯子4，12，51的3對引物，可檢測80%的缺失，若再用Beggs等設(shè)計的另外九對引物即外顯子3，6，13，46，47，49，50，52，30，60及啟動子的引物，進行多重PCR，可使98%的缺失型患者得到診斷，各引物的序列及擴增片段大小見表. 在用多重PCR進行DMD/BMD基因的缺失型檢測時方便簡便，快速，在擴增后，用瓊脂糖凝膠電泳溴乙錠染色可根據(jù)擴增產(chǎn)物的有無判斷結(jié)果.擴增時的分清情況見下表: DMD基因PCR擴增引物
(二)單個堿基置換的檢測 單堿是置換在DMD/BMD的發(fā)生中占有重要地位，但DMD/BMD是因單堿基置換近年來才受到人們的重視，它對發(fā)現(xiàn)新突變，確定單堿基置換與DMD/BMD發(fā)生的關(guān)系具有重要意義，推測的方法主要是用RT-PCR-SSCP及全套式RF-PCR檢測. (三)利用PCR-RFLP和Amp-FLP進行連鎖分析診斷DMD/BMD 若在一個家庭中，已有一個先證者，則首先利用多重PCR檢測其缺失，若不能確定其缺失的部位或不能診斷，或其它條件所限，則可用PCR-RFLP和Amp-FLP進行連鎖分析，確定風(fēng)險染色體. 1.PCR-RFLP 用多重PCR不能檢出非缺失型DMD/BMD患者及攜帶者，現(xiàn)在可用PCR方法擴增多態(tài)性位點區(qū)域，同適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶酶解擴增產(chǎn)物，電泳分離后可對多態(tài)性位點進行分布，利用PCR-RFLP連鎖分析，即可進行DMD/BMD風(fēng)險個體的攜帶者的檢出，下表序列即為常用的幾個多態(tài)性位點檢測時的引物及擴增酶解情況.
2.AmP-FLP 在DMD/BMD基因區(qū)內(nèi)有多個(CA)n重復(fù)區(qū)域，這些區(qū)域可用OCR方法進行擴增，增產(chǎn)物同聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)進行分析擴增片段大小，然后與先證者及母親進行對比，亦是檢出患者與攜帶者的理想多態(tài)性標(biāo)記，現(xiàn)將在我國人群中已作分析的(CA)n區(qū)引物及多態(tài)性片段，PIC列表示下:
不應(yīng)用內(nèi)含子進行連鎖分析時，可用44/49，45/50兩組雙重PCR同時擴增，亦可在這些組中，將缺失熱點的引物加入，形成多復(fù)PCR，連鎖分機與缺失檢測同時進行. 五、DMD/BMD的PCR快速前診斷 過去DMD/BMD的PCR快速產(chǎn)前基因診斷主要采用RFLP連鎖分析，由于該方法探作復(fù)雜費時，提供的信息量有限，因此不能滿足臨床診斷的要求，目前主要應(yīng)用PCR法進行產(chǎn)前診斷. 產(chǎn)前快速基因診斷常用以下兩種途徑 1.四步法: (1)性別確定.━━(SRY引物＋DMD課題內(nèi)對照) (2)先證者缺失型基因檢測(多重PCR) (3)胎兒缺失型的確定(多重PCR＋單對引物PCR) (4)Amp-FLP＋PCR-RFLP確定非缺失型式攜帶者 2.一步列位法:董尚志等人在上述方法的基礎(chǔ)上建立了一步到位快速法，該系統(tǒng)包括以下三組多重PCR體系. ①5'pmCA＋e12＋MP1P ?、趀17＋44CA＋49CA ?、踖17＋45CA＋50CA 應(yīng)用上述三組多重PCR不僅可將女性的兩條×染色體分開.而且能檢出染色體的.另有一組，SRr＋e44定胎兒性別及44外顯子的缺失.一步到位法快速，方便，它不僅能檢測缺失，亦可對非缺失型的DMD/BMD進行連鎖分析. |
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