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          生物知識(shí)

          PCR技術(shù)應(yīng)用十一:病毒學(xué)診斷

          作者:admin 來源:本站 發(fā)布時(shí)間: 2011-01-05 11:08  瀏覽次數(shù):
          購買進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 kjhfd.cn

          甲型肝炎病毒是甲型肝炎的病原體.甲型肝炎呈世界性分布,其傳染源是甲型肝炎病人及病毒攜帶者.HAV主要隨糞便排出,但在血液、唾液、膽汁和十二指腸液也可查出.本病的傳播主要是通過糞--口途徑,如經(jīng)日常生活接觸傳播,經(jīng)污染飲水或食物而傳播.其中無黃疸型肝炎患者容易漏診或誤診,是重要的傳染源,具有重要的流行病學(xué)意義.除病人外,還有亞臨床感染,其無癥狀或有較輕微病狀,轉(zhuǎn)氨酶輕度升高,血清中可查出抗HAVIgM,糞便中可檢出HAAg或HAV顆粒,亦是不可忽視的較重要的傳染源.

            甲型肝炎病毒經(jīng)糞--口途徑進(jìn)入消化道后,首先在腸上皮和局部淋巴結(jié)細(xì)胞內(nèi)繁殖,然后進(jìn)入血液形成病毒血癥,經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)其靶器官--肝細(xì)胞中定居繁殖,引起肝功能異常,出現(xiàn)發(fā)熱、鞏膜黃染、小便濃茶色、惡心、厭油膩、血清轉(zhuǎn)氨酶升高等癥狀或體征.

            甲型肝炎病毒為單股正鏈RNA病毒.直徑約27nm、呈20面立體對(duì)稱的球形顆粒,1982年國際病毒分類委員會(huì)曾將其分類為微小RNA病毒科腸病毒72型,隨著對(duì)HAV的不斷深入研究,發(fā)現(xiàn)其與腸病毒屬的成員有很多不同之處,國際病毒分類委員會(huì)于1991年將HAV重新分類為小RNA病科肝病毒屬,也有人建義命名為肝RNA病毒屬.它即強(qiáng)調(diào)了HAV的嗜肝性,又突出了HAV的基因是RNA,同時(shí)又與HBV嗜肝DNA病毒屬相對(duì)應(yīng).

          一、甲型肝炎病毒的分子生物學(xué)

          (一)HAV基因組

            HAV全基因約含7500個(gè)核苷酸,各HAV株間序列中的核苷酸數(shù)略有不同.其中HAV野毒株HM-175基因組全長7478個(gè)核苷酸,分5'端非編碼區(qū)和3'非編碼區(qū)及居于中間的開放閱讀框架區(qū)(編碼區(qū))三部分.5'端非編碼區(qū)是HAV基因組中最保守的部分.其株間核苷酸序列一致性達(dá)96~99%.此區(qū)共有734個(gè)核苷酸.5'非編碼區(qū)有2個(gè)聚嘧啶環(huán),鄰近5'端的第一個(gè)聚嘧啶環(huán)是獨(dú)特的,不為其它RNA病毒所共有;第二個(gè)聚嘧啶環(huán)位于編碼區(qū)的起點(diǎn)附近,與其它小RNA病毒同源.5'非編碼區(qū)含有識(shí)別和連接宿主核蛋白體的重要遺傳信息.開放閱讀框架區(qū)編碼2227個(gè)氨基酸的多聚蛋白.被一個(gè)天門冬酰胺密碼子分開的2個(gè)蛋氨酸密碼中的任何一個(gè)可能是翻譯的起點(diǎn).其編碼多聚蛋白的基因從5'端開始可分為三個(gè)區(qū),即P1區(qū)、P2區(qū)和P3區(qū).P1區(qū)編碼4個(gè)衣殼蛋白1A~1D,通常稱為VP1、VP2、VP3和VP4.VP1最大可能和VP3一起構(gòu)成抗原的免疫決定簇.P2區(qū)是轉(zhuǎn)錄及基因調(diào)控區(qū).P3區(qū)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白3A、3B、3C和3D,HAV蛋白3B可共價(jià)結(jié)合于HAVRNA5'端,與啟動(dòng)RNA的生物合成或與病毒的裝配有關(guān);HAV3D蛋白為依賴RNA的RNA多聚酶.代表了多聚酶的活性部位.

            P1區(qū):位于HAVRNA735~3107位核苷酸區(qū)域,為HAV衣殼蛋白編碼區(qū),可編碼791個(gè)氨基酸.從5'端開始按其次序分別稱為VP4(735~803),VP2(804~1469),VP3(1470~2207),VP1(2208~3107).

          (二)HAVRNA的基因型

            HAV只有一個(gè)血清型.但通過對(duì)HAV核酸序列分析,發(fā)現(xiàn)HAV有若干個(gè)基因型.1991年Robertson用HAVP1區(qū)VP1基因的不同片段作為分型標(biāo)準(zhǔn),將22株來自世界不同地區(qū)的HAV分為三個(gè)基因型(Ⅰ~Ⅲ型),1992年他又對(duì)全球29個(gè)國家的152株HAV,以VP1和P2區(qū)的不同序列作基因分型,根據(jù)基因分型標(biāo)準(zhǔn),把核苷酸序列差異<15%的劃為同一基因型.從而將HAV分為7個(gè)基因型(Ⅰ~Ⅶ型),人類HAV有四個(gè)型,(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ),非人靈長類亦有四個(gè)型(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ).其中的Ⅲ型為人類和非人靈長類所共有的混合型.人類HAV各基因型間,核苷酸異源性為15~20%.同一基因型的不同亞型之間,異源性低于7.5%,同一亞型的地方流行株核苷酸異源性低于3%.但變異的核苷酸大多發(fā)生在密碼子的第三位上,不會(huì)改變氨基酸的組成,故各株間的抗原性差異不大.

          (三)基因變異

            HAV的變異主要有自然變異,生物學(xué)變異和細(xì)胞培養(yǎng)變異及減毒變異.自然變異主要發(fā)生在P1區(qū),其中VP1和VP3區(qū)變異較多見.HAV氨基酸的變異常發(fā)生在VP3的65、70和VP1的102、105、174、178和221位,而VP3的70位幾乎在所有的HAV株中都存在變異.

            Funkhouser等將在AGMK細(xì)胞上培養(yǎng)生長的HAV-175株,轉(zhuǎn)種到MRC-5細(xì)胞上培養(yǎng),然后進(jìn)行核苷酸序列比較分析,發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)種株(適應(yīng)株)有13個(gè)核苷酸發(fā)生變異.其中有4個(gè)在5'非編碼區(qū),9個(gè)在編碼區(qū),Cohen等對(duì)HAV野毒株HM-175和減株HM-175/7MK5的cDNA核苷酸序列進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)有24個(gè)核苷酸發(fā)生變異,并導(dǎo)致12個(gè)氨基酸發(fā)生了變異.其中5'非編碼區(qū)有7個(gè)核苷酸發(fā)生變異,P1、P2和P3區(qū)分別有3、8和5個(gè)核苷酸發(fā)生變異;3'端非編碼區(qū)有一個(gè)核苷酸變異,因而認(rèn)為HAV的減毒是由于其基因組中相對(duì)小量的核苷酸改變所致.生物學(xué)變異主要是在核苷酸變異的基礎(chǔ)上,發(fā)生了對(duì)細(xì)胞的親和性的改變及HAV毒力性的改變.

          (四)引物的設(shè)計(jì)

          序號(hào)
          引物序列
          位置
           
          擴(kuò)增片段(bp)
          1.
          FA,5'-GGAAATGTCTCAGGTACTTTCTTTG
          2390~2414
          互補(bǔ)鏈
          248bp
           
          FB,5'-GTTTTGCTCCTCTTTATCATGCTATG
          2167~2192
           
           
          2.
          FA,5'-GGCCCACTGGAGTAAACCAGGCCA
          2674~2697)
          互補(bǔ)鏈
          531bp
           
          FB,5'-GTTTTGCTCCTCTTTATCATGCTATG
          2167~2192
           
           
          3.
          F1,5'-CAACTGCAGCCAGTGCTCCAGACACGGC
          2838~2865)
          互補(bǔ)鏈
          715bp
           
          F2,5'-AGGAATTCACTTGAATGTTTTGCTCCTCTT
          2150~2179)
           
           
          4.
          P∶5'-TCCCAGAGCTCCATTGAA-3'
          2976~2993)
          互補(bǔ)鏈
          300bp
           
          N∶5'-CATTATTTCATGCTCCTCAG-3'
          3257~2376
           
           

          二、病原學(xué)檢測現(xiàn)狀

            1.HAV及HAAg的檢測:在潛伏期未與發(fā)病早期可用免疫電鏡檢出HAV,亦可用RIA和ELISA檢測血、尿、糞中的HAAg,此期也可采取上述標(biāo)本對(duì)HAV進(jìn)行培養(yǎng)鑒定.

            2.檢測抗HAV、抗-HAVIgM和抗HAVIgA:急性期可用ELISA或RIA檢測血清中抗-HAVIgM,它是確診甲型肝炎的特異性血清學(xué)指標(biāo).其次抗-HAVIgA對(duì)于甲肝的早期診斷亦有意義.

            3.HAVRNA:甲肝潛伏期與急性期早期,在血、尿、糞中用PCR技術(shù)或分子雜交檢測到HAVRNA,即可確診.

          三、PCR應(yīng)用評(píng)價(jià)

            由于在急性期與潛伏期未在血、尿、糞中均有HCV存在,用PCR技術(shù)擴(kuò)增檢測HCVRNA,非常適用于甲肝的早期診斷.它不僅可用于現(xiàn)癥病人的早期診斷,還能用于亞臨床感染者、隱性感者的檢測及環(huán)境污染HAV的監(jiān)測.是進(jìn)行流行病研究的重要手段.

            但HCV是RNA病毒,做PCR時(shí)先要將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后才能做PCR,而且一般要做巢式或雙PCR才能得出好的結(jié)果.其技術(shù)要求精度較高,程序較為繁復(fù),但其特異性與敏感度是其它技術(shù)不可比擬的.

          四、進(jìn)一步深入研究的課題方向

          (一)用PCR進(jìn)行分型研究

            建立HAVPCR分型方法,使HAV的流行病學(xué)研究進(jìn)入分子水平,用其來分析HAV的流行因素,流行特征及地理分布,確定暴發(fā)與傳染源之間的聯(lián)系,對(duì)甲型炎肝的防治具有重要意義.

          (二)毒力的分子生物學(xué)研究

            研究HAV毒力的分子學(xué)基礎(chǔ),有助于分析研究野毒株與減毒株之間核苷酸的變異性情況,確認(rèn)疫苗毒力減弱的基因標(biāo)志,可用于制備基因工程疫苗、監(jiān)視疫苗可能出現(xiàn)的回復(fù)突變.

          乙型肝炎病毒

            乙型肝炎是一種世界性傳染病,我國是高流行區(qū),我國有50%~70%的人群受過乙型肝炎病毒的感染,有8%~10%為乙型肝炎表面抗原攜帶者,約有一億人口,根據(jù)1980年全國調(diào)查表明,我國現(xiàn)在患肝炎的病人約2000萬人,其中60%以上為慢性肝炎患者.乙型肝炎病毒又與肝硬變以及原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌密切相關(guān),我國同時(shí)也是肝癌的高發(fā)國家;如何預(yù)防、如何治療、急待解決.解決這一問題的關(guān)鍵之一在于準(zhǔn)確無誤的診斷,要達(dá)到準(zhǔn)確無誤的診斷,就需要深入細(xì)致的研究乙型肝炎病毒的分子生物學(xué)特點(diǎn),盡可能地采用現(xiàn)代分子生物技術(shù)加以研究和檢測.

          (一)病原學(xué):HBV為嗜肝DNA病毒(hepadna Virus).

            1.形態(tài):完整的HBV顆粒呈園形,直徑42nm,雙層結(jié)構(gòu),由外殼蛋白和核心成分組成.外殼蛋白包括S、前S1和前S2蛋白,核心成分則包括核心蛋白(HBCAg)、病毒(HBVDNA)和DNA多聚酶(DNA).

            2.基因組:HBV基因組由一環(huán)形、部分雙鏈DNA組成.HBVDNA長鏈(一)約3.2Kb、短鏈S(+)約為400~1900bp.該基因組包括4個(gè)可被轉(zhuǎn)錄的開放讀碼區(qū)域---S、C、P和X區(qū),P區(qū)與另外三個(gè)區(qū)重疊.S區(qū)由前S1、前S2和S基因組成,主要碼組成病毒外殼的三種不同蛋白,即大蛋白、中蛋白和主蛋白,C區(qū)編碼白(HBAg).P基因編碼病毒DNA多聚酶,為復(fù)制所必需.X基因產(chǎn)物為X蛋白,與HBV反式激活等功能有關(guān).

          (二)流行病學(xué)

            1.地區(qū)分布:呈世界性分布,但不同地區(qū)差異很大,按人群中HBsAg攜帶率高低可劃分為三類:①低流行區(qū)(攜帶率<1%),如北美、北歐、英等;②中流行區(qū)(1-5%),如南歐、西南亞、俄羅斯等;③高流行區(qū)(10-20%).如東南亞、非洲和我國等.另外HBs5Ag的亞型地理分布也有明顯差異.adr多見于東南亞和我國;adw多見于美洲,澳大利亞和北歐;ayr罕見;而ayw分布最廣,由西非、北非、南歐、經(jīng)地中海至中東、南亞次大陸.

            2.傳染源:各種類型的乙肝患者和HBsAg攜帶者.潛伏期為6周至6個(gè)月,平均為3個(gè)月.

            3.傳播途徑:由于HBV存在于血液,唾液、淚液、腹水、羊水、尿、精液、陰道分泌物、月經(jīng)血和乳汁等中,所以傳播途徑多樣且復(fù)雜.但主要經(jīng)血液、母嬰和接觸傳播.

          (三)引物的設(shè)計(jì)

           
          序列
          位置
          片段大小(bp)
          HPV6/11
          引物15'ATGCCTCCACGTCTGCAAC3'
          115133
          112
           
          引物23'TACGTGACTGGTGGCCGTCTC5'
          208227
           
          HPV16/33
          引物15'TGAGGTATATGACTTTGCTTTT3'
          223244
          183
           
          引物23'AATTAATCCACATAAT5'
          401416
           
          HPV18
          引物15'TGTCATAACCTTGAATGTCT3'
          428437
          99
           
          引物23'AAATGTATAGATTTTTATTC5'
          508507
           

          HPV型特異型引物

          型別
          序列
          片段大小(bp)
          HPV6
          引物15'AGACCAGTTGTGCAAGACGTTTAA3'
          263
           
          引物23'GATTTGTTCTGTAGAATCTGCACG5'
           
          HPV11
          引物15'AGACCAGTTGTGCAAGACGTTTAA3'
          144
           
          引物23'ACACACCGCTCTGTTGAAAGGGAA5'
           
          HPV16
          引物15'ACCGAAACCGGTTAGTATAAAAGC3'
          576
           
          引物23'TAAACGTTGGTCTCTGTTGACTAG5'
           
          HPV18
          引物15'CACACCACAATACTATGGCGCGCT3'
          360
           
          引物23'CGGTCTTTGGCAACTTAGGTCGTC5'
           
          HPV33
          引物15'GCAGTAAGGTACTGCACGACTATG3'
          413
           
          引物23'TGCTAAAGTATTATAAAGCCCAGC5'
           

            目前研究所采用的引物主要為上述幾種,從而構(gòu)成了HPV通用型診斷試劑和分型診斷試劑,其中,分型診斷試劑組成了5重性,即將HPV633各型引物混合在一起,一次PCR實(shí)驗(yàn),即可對(duì)5種型別的HPV感染進(jìn)行確診.

            應(yīng)用前景:PCR技術(shù)在診斷HPV感染和致癌研究中有其廣闊的應(yīng)用前景.現(xiàn)已應(yīng)用于檢測宮頸陰道組織細(xì)胞、陰肛部腫瘤、多種疣組織和口腔粘膜細(xì)胞中的HPV.由于該方法使簡便快速,可應(yīng)用于大范圍內(nèi)的流行病調(diào)查.

            PCR檢測HPV的核心問題:是如何使PCR發(fā)揮其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值.以往,PCR應(yīng)用于實(shí)際檢測中的限制在于方法的繁瑣與較高的假陽性,如何克服這兩個(gè)問題是促成PCR臨床實(shí)際應(yīng)用的關(guān)鍵.從理論上講,PCR方法可以變得更為簡潔和定固化,亦即程序化,其結(jié)果應(yīng)是100%的特異和可靠.所以,實(shí)際工作是可以解決好上述兩個(gè)關(guān)鍵問題的.首先,應(yīng)用于PCR的關(guān)鍵試劑為TaqDNA聚合酶和特異引物對(duì),作為TaqDNA聚合酶,它對(duì)模板的種類要求不嚴(yán),它有很強(qiáng)的適應(yīng)性,活性范圍亦很好(7079)因而它可對(duì)較為“粗糙”的標(biāo)本進(jìn)行較好的擴(kuò)增,故樣品的準(zhǔn)備過程的程度對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)本身來講,影響不大,實(shí)踐中我們對(duì)該過程進(jìn)行了大量的簡化及改造,從而獲得成功,這極有利于PCR的常規(guī)化,易于為實(shí)驗(yàn)者所接受.另外重要的一點(diǎn)還有,簡化及快速的PCR程序,對(duì)于防止假陽性更有利.因?yàn)?font face="Times New Roman">PCR的假陽性經(jīng)常是因?yàn)闃悠烽g的交叉污染及空氣中的擴(kuò)增污染造成的,簡短,快速的實(shí)驗(yàn)程序能有效的的防止上述污染,這已為實(shí)踐所證明.PCR引物的特異性取決于引物的設(shè)計(jì),選擇合適的擴(kuò)增片段是設(shè)計(jì)引物的關(guān)鍵環(huán)節(jié).

            總之,PCR檢測HPV不管從特異性方面還是從靈敏性方面講具有其經(jīng)方法難以匹敵的優(yōu)勢(shì),結(jié)果的可靠性及可信性應(yīng)該是最好的,是最權(quán)威性的檢測方法,加之本身方法的極大進(jìn)步,對(duì)于擴(kuò)充其應(yīng)用領(lǐng)域極其重要。

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