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[轉(zhuǎn)載]MIRNA(microRNA)檢測實(shí)驗(yàn)流程(加polyA法)(

作者：admin 來源：本站發(fā)布時(shí)間： 2013-06-17 22:48　瀏覽次數(shù)：

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LONZA 龍沙細(xì)胞培養(yǎng)基

1、治療級(jí)無血清間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基

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5、UltraCHO無血清CHO細(xì)胞培養(yǎng)基

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20、ProVero 1無血清培養(yǎng)基

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一：概述

microRNA(miRNA)是一類有大約22個(gè)核苷酸組成的非編碼小分子RNA，其廣泛存在于真核生物中。miRNA在個(gè)體發(fā)育的不同時(shí)期及不同組織中有不同的表達(dá)模式，都表明了其在發(fā)育和分化中起有重大的調(diào)控作用。迄今為此，對(duì)miRNA的檢測方法主要有Northern Blot 等基于分子雜交的方法，這些方法敏感度低、耗時(shí)長、RNA的用量較大。miRNA qPCR Detection Kit采用了國際上公認(rèn)的核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)――Real-Time PCR技術(shù)來對(duì)miRNA進(jìn)行檢測，其具有快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

以下主要是以miRNA qPCR Detection Kit來對(duì)miRNA進(jìn)行檢測的實(shí)驗(yàn)操作流程：

二：背景資料

檢測人腦組織中miRNA的表達(dá)。所選的miRNA及其擴(kuò)增長度信息如下：

	Primer ID	Mature_Acc	Mature_ID	PCR_SIZE
1	hsmq-0031_01	MIMAT0000069	has-miR-16	75
2	hsmq-0032_01	MIMAT0000422	hsa-miR-124	73
3	hsmq-0033_01	MIMAT0000443	hsa-miR-125a-5p	77
4	hsmq-0034_01	MIMAT0000423	hsa-miR-125b	75
5	hsmq-0035_01	MIMAT0000429	hsa-miR-137	76
6	hsmq-0036_01	MIMAT0000250	hsa-miR-139-5p	75
7	hsmq-0037_01	MIMAT0000437	hsa-miR-145	76
8	hsmq-0038_01	MIMAT0000450	hsa-miR-149	76
9	hsmq-0039_01	MIMAT0000439	hsa-miR-153	75
10	hsmq-0040_01	MIMAT0000452	hsa-miR-154	75
11	hsmq-0041_01	MIMAT0000259	hsa-miR-182	77
12	hsmq-0042_01	MIMAT0000261	hsa-miR-183	75
13	hsmq-0043_01	MIMAT0000458	hsa-miR-190	75
14	hsmq-0044_01	MIMAT0000276	hsa-miR-219-5p	74
15	hsmq-0045_01	MIMAT0000077	hsa-miR-22	75
16	hsmq-0046_01	MIMAT0000082	hsa-miR-26a	75
17	hsmq-0047_01	MIMAT0000100	hsa-miR-29b	76
18	hsmq-0048_01	MIMAT0000244	hsa-miR-30c	76
19	hsmq-0049_01	MIMAT0000441	hsa-miR-9	76
20	hsmq-0050_01	MIMAT0000689	hsa-miR-99b	75
21	hsnRNA-U6_01	M14486	hsnRNA-U6	81

三：實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

RNA抽提、RNA 加“PolyA”處理、RNA反轉(zhuǎn)錄、定量PCR檢測及其數(shù)據(jù)分析。

四：實(shí)驗(yàn)主要儀器和試劑

主要實(shí)驗(yàn)儀器:冷凍離心機(jī)、常規(guī)PCR儀、分光光度計(jì)、電泳系統(tǒng) iQ5 Real Time PCR Detection System。

主要實(shí)驗(yàn)試劑:TRIzol（Invitrogen）、RNA級(jí)氯仿、冷凍異丙醇及冷凍的75%乙醇、DEPC滅菌水、液氮、10×Mops、甲醛、10×RNA電泳緩沖液、miRNA qPCR Detection Kit。

五：實(shí)驗(yàn)操作

前期準(zhǔn)備:為避免RNase 對(duì)RNA的降解及其提高實(shí)驗(yàn)的精確性，在實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)準(zhǔn)備好用DEPC處理過的離心管及其移液槍頭，同時(shí)實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，需戴口罩及其一次性手套。所有實(shí)驗(yàn)操作盡可能在冰上進(jìn)行Total RNA抽提。

1、樣品處理:取50mg～200mg樣品直接在液氮中研磨至粉末，再轉(zhuǎn)移一定量至含1mLTRIzol的離心管中，反復(fù)振蕩裂解組織細(xì)胞。（Note：如為貼壁細(xì)胞，去培養(yǎng)基后可直接加入TRIzol(5~10×107細(xì)胞數(shù)加約為1mLTRIzol)，反復(fù)吹打裂解細(xì)胞，再收集TRIzol至離心管中；如為懸浮細(xì)胞，離心收集懸浮細(xì)胞，加入TRIzol(5~10×107細(xì)胞數(shù)加約為1mLTRIzol)反復(fù)吹打裂解細(xì)胞）。

2、相分離:室溫放置上述樣品液10min左右后，每1mLTRIzol 中加入氯仿為200μL，蓋上蓋子，劇烈振蕩約1min，室溫靜置5min，然后12000g 冷凍離心15min（4℃），小心取出樣品，通過觀察可以發(fā)現(xiàn)樣品分三層，其中最上層含有RNA樣品。

3、RNA沉淀:小心吸取上清液約450μL（每1mLTRIzol 的吸取量）至含有600μL冷凍異丙醇的新離心管中，混勻，12000g 冷凍離心10min（4℃）。

4、RNA洗滌:去上清，加入500μL 冷凍的75％乙醇，彈起沉淀后 12000g 冷凍離心5min（4℃），去上清，再稍離，吸去上清液。

5、RNA溶解:風(fēng)干約5～10min（注意不能風(fēng)太干，只需要沉淀泛白即可），加入DEPC水約30μL。貼上標(biāo)簽后-80℃保存。

6、RNA濃度測定:吸取1μL 抽提的RNA 用DEPC水稀釋10倍后，在分光光度計(jì)Nanodrop上測定RNA濃度，以DEPC水做空白對(duì)照，同時(shí)記錄RNA濃度及其OD260/OD280。Note：如為常規(guī)的分光光度計(jì)，注意比色杯測定時(shí)的最少所需體積量，取一定量的RNA，用DEPC水稀釋約100倍左右，同時(shí)在紫外條件下測定OD260和OD280，再按照公式計(jì)算RNA濃度＝40ng/μL×OD260×稀釋倍數(shù)）。

7、RNA電泳檢測：
7.1 變性膠制備：取1.2g Agarose + 75mL去離子水煮沸，冷卻至70℃左右加入10mL10×Mops和15mL甲醛及EB。倒膠至寬口梳子的膠板上，蓋上蓋子。

7.2 電泳緩沖液配制(1×Mops)：取50mL10×Mops ，用去離子水稀釋至500mL，倒入電泳槽中。

7.3 RNA樣品處理：取RNA樣品約3μL，最后補(bǔ)充DEPC水至15μL，65℃變性10min后立即冷卻，加入2μL 10×RNA loading buffer 即可電泳。

7.4 RNA電泳：先把RNA膠放入電泳槽中，100V作用電泳約5min，再在點(diǎn)樣孔中點(diǎn)入處理過的RNA樣品，100V左右電泳至溴酚藍(lán)至膠的1/3處，取膠拍照。

8、RNA抽提結(jié)果:
8.1. RNA電泳圖（取3ul RNA 樣品）：

8.2 RNA電泳的各泳道所對(duì)應(yīng)的樣品及其樣品濃度和OD ₂₆₀/OD_280。

RNA來源	RNA濃度(ng/ul )	OD ₂₆₀/OD₂₈₀
人腦組織	3470	1.9

9、miRNA 3’端進(jìn)行加“Poly A”處理

融解加“PolyA”反應(yīng)所需的試劑，上下輕微顛倒混勻，短暫離心后放置冰上待用。
PolyA Reaction 反應(yīng)液的配制

在冰上的預(yù)冷RNase free 的反應(yīng)管內(nèi)加入以下試劑至總體積20μL

試劑組分	體積	終濃度
Total RNA		2μg
2.5U/μLPolyA Polymerase	1μL	2.5U
10×PolyA Polymerase Buffer	2μL	1×
10×rATP Solution	2μL	1×
ddH2O(RNase/DNase free)	補(bǔ)至20μL

在反應(yīng)中使用的total RNA必須含有小分子RNA。
Total RNA使用量可在100ng～10μg之間調(diào)整，如使用純化的小分子RNA，其使用量可在10ng～1μg之間調(diào)整。

10、PolyA反應(yīng)：

混勻配制的反應(yīng)mix，短暫離心后在37℃反應(yīng)15min。所得的反應(yīng)液可以直接進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)，也可以放置-20℃短暫保存，如需長期保存建議存放于-80℃。

11、Poly A化的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：

融解反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需的試劑，上下輕微顛倒混勻，短暫離心后放置冰上待用。RNA-Primer Mix 的配制反應(yīng)：
在冰上預(yù)冷的RNase free 的反應(yīng)管內(nèi)加入以下試劑至總體積13μL

試劑組分	體積	終濃度
PolyA反應(yīng)液	2μL
25×Oligo dT Adaptor	1μL	1×
ddH2O(RNase/DNasfree)	10μL
Final Volume	13μL

混勻RNA-Primer Mix，短暫離心，直接65℃變性10min后立即放置冰上至少2min。

配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：

在RNA-Primer Mix反應(yīng)管內(nèi)加入以下試劑至總體積25μL。

試劑組分	體積	終濃度
RNA-Primer Mix	13μL
5×RT Reaction Buffer	5μL	1×
25mM dNTP	1μL	1mM
25U/μL RNase Inhibitor	1μL	25U
200U/μL M-MLV RTase (RNase H free)	1μL	200U
ddH2O(RNase/DNase free)	4μL
Final Volume	25μL

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):
混勻配制的反應(yīng)mix，短暫離心后在42℃反應(yīng)60min, 再進(jìn)行85℃ 5min滅活處理。所得的單鏈cDNA 放置于-20℃保存。

12、qPCR 檢測miRNA.

miRNA檢測引物設(shè)計(jì)：miRNA qPCR Detection Kit 中已提供有miRNA檢測的Reverse 通用引物：“Universal adaptor PCR Primer”，F(xiàn)orward 檢測引物需客戶參考miRNA序列自行設(shè)計(jì)或直接從我公司定購以驗(yàn)證的引物。因?yàn)閙iRNA序列長度一般都在18～24nt之間，所以其檢測的 Forward 檢測引物一般都直接選用其miRNA序列或?yàn)樵黾悠錂z測的特異性而特殊設(shè)計(jì)的序列：如有的miRNA GC含量偏高或引物易形成引物二聚體，其引物可為miRNA 3’端去除幾個(gè)堿基后整理的序列。

miRNA qPCR Forward Primer 設(shè)計(jì)舉例（以小鼠mmu-miR-125b-5p為例）：
在miRNA Database中查找檢測的miRNA序列，如下圖所示：
miRNA Database：http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/search.shtmL

則其Forward 檢測引物可為：

miRNA sequence	ucccugagacccuaacuuguga
Primer sequence	tccctgagaccctaacttgtga （Tm：58.8）

融解2×qPCR mix(如有必要，融解50×ROX Reference Dye)上下輕微顛倒混勻，短暫離心后放置冰上待用。冰上進(jìn)行qPCR反應(yīng)液的配制（所有miRNA進(jìn)行復(fù)孔測試，同時(shí)進(jìn)行單孔NTC（No template control）測試）

試劑組分	體積	終濃度
2×qPCR Mix	10μL	1×
qPCR Forward Primer（2μM）	2μL	0.2μM
Universal Adaptor PCR （2μM）	2μL	0.2μM
1st strand cDNA（diluted 1:5）	2μL
ddH2O	4μL
Final Volume	20μL

1）2×qPCR Mix設(shè)定為總反應(yīng)體積的一半，其它組分請(qǐng)按最適比例進(jìn)行調(diào)整。如需變更總反應(yīng)體積，請(qǐng)保持最適條件下各組分的比例。
2）Rox Reference Dye使用在需要用Rox 校正的Real-Time PCR儀，如ABI的定量PCR儀。
3）引物終濃度可在0.2μM～0.4μM范圍內(nèi)調(diào)整，一般條件下0.2μM的量即可達(dá)到理想的效果。
4）1st Strand cDNA 通常需要稀釋后再使用，防止反轉(zhuǎn)錄體系對(duì)qPCR體系的影響。
5）充分混勻qPCR反應(yīng)液，添加至PCR反應(yīng)管中，短暫離心，確保所有試劑到反應(yīng)管底部。
6）qPCR 反應(yīng)，使用標(biāo)準(zhǔn)的三步法進(jìn)行檢測（以Bio-Rad 的iQ5進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)）。

循環(huán)數(shù)	步驟	溫度	時(shí)間	檢測
1	預(yù)變性	95℃	10min	否
	變性	95℃	10sec	否
40	退火	57℃	20sec	否
	延伸	72℃	10sec	是

對(duì)于用SYBR Green 染料法進(jìn)行的qPCR的檢測的反應(yīng)都需要在循環(huán)結(jié)束后立即進(jìn)行融解曲線分析（以Bio-Rad 的iQ5進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)）

檢測溫度范圍	升溫速率	恒溫時(shí)間	檢測
70℃～95℃	0.5℃/次	6 sec/次	是
30℃		30sec	否

1）、2×qPCR Mix 中采用的DNA聚合酶為經(jīng)過特殊修飾的熱啟動(dòng)酶，95℃ 10min能充分的激活酶活性。
2）、因miRNA的特殊性從而導(dǎo)致了其引物的特殊性，在檢測時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制退火溫度，防止出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。
3）、進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的Oligo dT Adaptor其長度為53nt，為此PCR擴(kuò)增得到的片段長度一般在75bp左右（miRNA序列一般為22nt左右），所以延伸只需10sec即可。對(duì)產(chǎn)物的融解曲線判斷可以發(fā)現(xiàn)其Tm值一般都在79℃～83℃范圍內(nèi)，如果超出此范圍，建議使用別的方法來驗(yàn)證產(chǎn)物的特異性（如電泳）。

以上的反應(yīng)條件主要參考的為Bio-Rad 的iQ5定量PCR儀器，如使用的為不同公司的定量PCR儀，請(qǐng)按照不同的儀器要求，調(diào)整延伸時(shí)間及其融解曲線分析的條件。

六:結(jié)果分析

20個(gè)miRNA及其內(nèi)參U6的擴(kuò)增曲線及其融解曲線結(jié)果

20個(gè)miRNA及其內(nèi)參U6的電泳結(jié)果圖及其檢測原始平均Ct值

	Primer ID	Mature_ID	PCR_SIZE	組織	Sample Ave. Ct	膠泳道
1	hsmq-0031_01	has-miR-16	75	腦	27.02	1
2	hsmq-0032_01	hsa-miR-124	73	腦	22.98	2
3	hsmq-0033_01	hsa-miR-125a-5p	77	腦	27.81	3
4	hsmq-0034_01	hsa-miR-125b	75	腦	22.58	4
5	hsmq-0035_01	hsa-miR-137	76	腦	28.51	5
6	hsmq-0036_01	hsa-miR-139-5p	75	腦	30.66	6
7	hsmq-0037_01	hsa-miR-145	76	腦	24.7	7
8	hsmq-0038_01	hsa-miR-149	76	腦	29.71	8
9	hsmq-0039_01	hsa-miR-153	75	腦	27.61	9
10	hsmq-0040_01	hsa-miR-154	75	腦	30.39	10
11	hsmq-0041_01	hsa-miR-182	77	腦	34.64	11
12	hsmq-0042_01	hsa-miR-183	75	腦	33.86	12
13	hsmq-0043_01	hsa-miR-190	75	腦	32.28	13
14	hsmq-0044_01	hsa-miR-219-5p	74	腦	28.16	14
15	hsmq-0045_01	hsa-miR-22	75	腦	24.09	15
16	hsmq-0046_01	hsa-miR-26a	75	腦	22.66	16
17	hsmq-0047_01	hsa-miR-29b	76	腦	26.72	17
18	hsmq-0048_01	hsa-miR-30c	76	腦	26.54	18
19	hsmq-0049_01	hsa-miR-9	76	腦	23.11	19
20	hsmq-0050_01	hsa-miR-99b	75	腦	27.06	20
21	hsnRNA-U6_01	M14486	81	腦	22.26	21

原文地址：MIRNA(microRNA)檢測實(shí)驗(yàn)流程(加polyA法)作者：阮阮

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