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lonza 特殊 無血清 培養(yǎng)基
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問：RNA干擾各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)如何？
答：各種常用方法的優(yōu)缺點(diǎn)如下：
(1)化學(xué)合成dsRNA：優(yōu)點(diǎn)：快捷，通常6－8天內(nèi)就可以從供應(yīng)商處拿到定制的RNA oligo。 (2)體外轉(zhuǎn)錄dsRNA：優(yōu)點(diǎn)：價(jià)格相對(duì)低廉。缺點(diǎn)：操作困難、耗時(shí)。 (3)PCR制備編碼shRNA的轉(zhuǎn)錄DNAs：優(yōu)點(diǎn)：經(jīng)濟(jì)，較快捷。缺點(diǎn)：這種dsDNA導(dǎo)入細(xì)胞有一定難度。 (4)shRNA表達(dá)質(zhì)粒：優(yōu)點(diǎn)：基因干擾效果持久，經(jīng)濟(jì)；缺點(diǎn)：制備耗時(shí)；導(dǎo)入效率較低下；還涉及質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的定位、shRNA體內(nèi)折疊效率，非特異性基因抑制等。 問:siRNA設(shè)計(jì)的時(shí)候應(yīng)該注意什么？ 答：siRNA設(shè)計(jì)是一個(gè)需要由軟件完成的工作，但其中也有一般規(guī)律可尋： 1.起始密碼子75-100個(gè)以后，終止密碼子100個(gè)以前的片斷 2.GC比例在35-50之間，最好不要超過55% 3.設(shè)計(jì)好的序列必須進(jìn)行blast同源分析。需要提醒的是，對(duì)于任一個(gè)靶基因，RNAi的選擇都帶有一定的隨機(jī)性。
問：應(yīng)該使用什么溶劑溶解RNA，水還是緩沖液？
推薦使用1xTE緩沖液（在無RNase的條件下配制 10 mM TrisCl, pH7.5, 0.1 mM EDTA）溶解單鏈RNA，這將緩沖pH和鰲合金屬離子，減少RNA的降解。也可以使用無RNase水，雙鏈的RNA凍干自10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA，再次懸浮在適量的水中，RNA濃度到20μm，將恢復(fù)到相同的緩沖液。 問：如何在RNA oligo的OD、 nmol和質(zhì)量間進(jìn)行換算的？ 答：RNA oligo的OD、 nmol和質(zhì)量間有精確的公式可以計(jì)算，但一般情況下，對(duì)于一個(gè)21 bp 的siRNA oligo，有如下簡(jiǎn)單關(guān)系：1 OD duplex＝3 nmols＝40ug
問：現(xiàn)在RNA干擾的產(chǎn)品很多，應(yīng)該如何選擇RNA干擾產(chǎn)品？
答：現(xiàn)在市場(chǎng)上銷售的RNA干擾產(chǎn)品雖然很多，但大體可以分為兩類，一類是化學(xué)合成的RNA oligo；另一類是依托于分子生物學(xué)操作的試劑盒。這兩類產(chǎn)品目前都廣泛用于RNA干擾研究。作為剛剛進(jìn)入RNA干擾研究的用戶，比較好的研究路線是先針對(duì)你要研究的基因，合成一個(gè)由4～5對(duì)RNA oligo組成的一個(gè)RNA oligo 組，用這組RNA oligo篩選出具有明確基因下調(diào)作用的特定RNA oligo。下一步，可以根據(jù)您的研究需要，選擇使用載體或者使用合成相對(duì)大量的RNA oligo。一般情況下，如果后繼研究希望通過觀察基因持續(xù)下調(diào)研究基因功能，你需要選擇穩(wěn)定表達(dá)的載體系統(tǒng)；如果后繼研究希望觀察一個(gè)RNA 干擾片段作為藥物的作用和作用結(jié)果，就需要合成較大量的RNA oligo。
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