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| 購買進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 kjhfd.cn |
一、細(xì)胞培養(yǎng)基本概念 細(xì)胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出細(xì)胞摹擬體內(nèi)出現(xiàn)環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度及酸堿度和一定營養(yǎng)條件下，使期生長繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物為單個細(xì)胞或細(xì)胞群。 在醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的是外周血淋巴細(xì)胞、皮膚或纖維細(xì)胞和各種能在體外長期生長的細(xì)胞系。外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)具有時間短、技術(shù)簡便、可重復(fù)取材等優(yōu)點，它在臨床染色體分析中使用最廣泛。體外培養(yǎng)細(xì)胞株可在培養(yǎng)過程中發(fā)生自發(fā)的或在外界作用下的轉(zhuǎn)化，成為永久細(xì)胞系，也可直接建成永久細(xì)胞系，永久細(xì)胞系能在體外無取制的傳代和生長。永久細(xì)胞系通常具有非整倍體細(xì)胞和各個細(xì)胞的核型不完全相同特征。但細(xì)胞克隆的細(xì)胞系其這一特征可以不明顯。 二、細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境 細(xì)胞在體外培養(yǎng)中所需的條件與體內(nèi)細(xì)胞基本相同。 1、無污染環(huán)境 培養(yǎng)環(huán)境無毒和無菌是保證細(xì)胞生存的首要條件。當(dāng)細(xì)胞放置于體外培養(yǎng)時，與體內(nèi)相比細(xì)胞丟失了對微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代謝物質(zhì)積累等，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此在進(jìn)行培養(yǎng)中，保持細(xì)胞生存環(huán)境無污染、代謝物及時清除等，是維持細(xì)胞生存的基本條件。 2、恒定的溫度 維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度。人體細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)溫度為36.5℃±0.5℃，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。培養(yǎng)細(xì)胞對低溫的耐受力較對高溫強，溫度上升不超過39℃時，細(xì)胞代謝與溫度成正比；人體細(xì)胞在39-40℃1小時，即能受到一定損傷，但仍有可能恢復(fù)；在40-41℃1小時，細(xì)胞會普遍受到損傷，僅小半數(shù)有可能恢復(fù)；41-42℃1小時，細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，大部分細(xì)胞死亡，個別細(xì)胞仍有恢復(fù)可能；當(dāng)溫度在43℃以上1小時，細(xì)胞全部死亡。 3、氣體環(huán)境 氣體是人體細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生供給細(xì)胞生長增殖的能量和合成細(xì)胞生長所需用的各種成分。開放培養(yǎng)時一般把細(xì)胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環(huán)境中。 二氧化碳既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞生長繁殖所需成分，它在細(xì)胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的PH值。大多數(shù)細(xì)胞的適宜PH為7.2-7.4，偏離這一范圍對細(xì)胞培養(yǎng)將產(chǎn)生有害的影響。但細(xì)胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸環(huán)境中更利于細(xì)胞生長。有資料顯示，原代羊水細(xì)胞培養(yǎng)PH6.8時最適。 細(xì)胞培養(yǎng)液PH濃度的調(diào)節(jié)最常用的為加NaHCO3的方法，因為NaHCO3可供CO2，但二氧易于逸出，故最適用于封閉培養(yǎng)，而羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）因其對細(xì)胞無毒性，也起緩沖作用，有防止PH迅速變動的特性而用于開放細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中，其最大優(yōu)點是在開放式培養(yǎng)或細(xì)胞觀察時能維持較恒定的PH值。 4、細(xì)胞培養(yǎng)基 培養(yǎng)是既是培養(yǎng)細(xì)胞中供給細(xì)胞營養(yǎng)和促使細(xì)胞生殖增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是培養(yǎng)細(xì)胞生長和繁殖的生存環(huán)境。培養(yǎng)基的種類很多，按其物質(zhì)狀態(tài)分為半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類；按其來源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。 （1）合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞所需物質(zhì)的種類和數(shù)量嚴(yán)格配制而成的。內(nèi)含碳水化合物、氨基酸、脂類、無機鹽、維生素、微量無素和細(xì)胞生長因子等。單獨使用細(xì)胞雖有生存但不能很好的生長增殖。 （2）天然培養(yǎng)基：使用最普遍的天然培養(yǎng)基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多種細(xì)胞生長因子、促貼附因子及其多活性物質(zhì)。與合志培養(yǎng)基合用，能使細(xì)胞碩利增殖生長。常見使用最為5-20%。 三、細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)施和基本條件 1、實驗室設(shè)計 細(xì)胞培養(yǎng)是一種無菌操作技術(shù)，要求工作環(huán)境和條件必須保證無微生物污染和不受其它有害因素的影響。細(xì)胞培養(yǎng)室和設(shè)計原則是防止微生物污染和有害因素影響，要求工作環(huán)境清潔、空氣清新，干燥和無煙塵。細(xì)胞培養(yǎng)工作包括：工作液配制、無菌操作（采樣）、溫育、無菌處理，細(xì)胞和用品貯存等。細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)計實施原則一般是無菌操作區(qū)設(shè)在室內(nèi)較少走動的內(nèi)側(cè)，常規(guī)操作和封閉培養(yǎng)于一室，而洗刷消毒在另一室。 2、常用設(shè)施及設(shè)備 （1）超凈工作臺：也稱凈化工作臺，分為側(cè)流式、直流式和外流式三大類。 （2）無菌操作間：一般由更衣間、緩部間和操作間三部分組成。操作間放置凈化工作臺及二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機、倒置顯微鏡等。緩沖間可放置電冰箱、冷藏器及消毒好的無菌物品等。 （3）操作間：普通培養(yǎng)箱、離心機、水浴鍋、定時鐘、普通天平及日常分析處理物品。 （4）洗刷消毒間：烤箱、消毒鍋、蒸餾水處理器及酸缸等。 （5）分析間：顯微鏡、計算機及打印機等。 3、培養(yǎng)器皿 細(xì)胞培養(yǎng)以玻璃器皿為主，常準(zhǔn)備最需是使用最的三倍。器皿應(yīng)選擇透明度好、無毒、中性硬度玻璃制品。常用的玻璃器皿有下面幾種。 （1）液體儲存瓶：用于儲存各種配制好的培養(yǎng)液、血清等液體，常以500ml、250ml、100ml生理鹽水瓶或血漿瓶代替。 （2）培養(yǎng)瓶：根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞種類要求不同培養(yǎng)瓶的形態(tài)各異，用于細(xì)胞傳代培養(yǎng)的細(xì)胞要求瓶壁厚簿均勻，便于細(xì)胞貼壁生長和觀察，瓶口要大小一致，口徑一般不小于1cm，允許吸管伸入瓶內(nèi)任何部位，規(guī)格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml等幾種。用于外周血培養(yǎng)的常用10ml普通圓瓶。兩種培養(yǎng)瓶均要求選用優(yōu)質(zhì)玻璃制成。 （3）培養(yǎng)皿：用于開放式培養(yǎng)及其它用途。分直徑30mm、60mm、120mm等幾種。 （4）吸管：常用的有長吸管和短吸管兩類，長吸管也稱刻度吸管。其改良后管上部有球型刻度稱改良吸管，刻度吸管用于移動液體。常用1ml和10ml兩種。短吸管也叫滴管，分彎頭和直頭兩種。 （5）離心管：離心管是細(xì)胞培養(yǎng)中使用最廣泛的器皿，根據(jù)用途不同形態(tài)各樣，常用于細(xì)胞培養(yǎng)的離心管有大腹式尖底離心管和普通尖底離心管兩類。前者分別為50ml、30ml、15ml；后者則多為10ml和5ml。 （6）其它：如三角燒瓶、燒杯、量筒、漏斗、注射器等。 四、培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài) 體外培養(yǎng)細(xì)胞根據(jù)它們在培養(yǎng)器皿是否能貼附于支持物上生長特征，可分為貼附型生長和懸浮型生長兩大類。貼附型細(xì)胞在培養(yǎng)時能貼附在支技物表面生長。如羊水細(xì)胞為貼附型細(xì)胞，常表現(xiàn)為成纖維型細(xì)胞和上皮細(xì)胞生長。懸浮型細(xì)胞在培養(yǎng)中懸浮生長。 1、成纖維型細(xì)胞 在培養(yǎng)中的細(xì)胞凡形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似時，皆可稱之為成纖維細(xì)胞。本型細(xì)胞由形態(tài)與體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)相似而得名，細(xì)胞在支持物表面呈梭形或不規(guī)則三角形生長，細(xì)胞中央有卵園形核，胞質(zhì)向外伸出2-3厘米個長短不同的突起，除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間質(zhì)起源的組織細(xì)胞常呈本類形態(tài)生長。 2、上皮型細(xì)胞 此類型細(xì)胞在培養(yǎng)器皿支持物上生長具有扁平不規(guī)則多角形特征，細(xì)胞中央有園形核，細(xì)胞緊密相連單層膜樣生長。起源于內(nèi)、外胚層細(xì)胞如皮膚、表皮衍生物、消化管上皮等組織細(xì)胞培養(yǎng)時，皆呈上皮型形態(tài)生長。 3、游走型細(xì)胞 本型細(xì)胞在支持物上散在生長，一般不連成片。細(xì)胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運動，速度快且不規(guī)則。此型細(xì)胞不很穩(wěn)定，有時亦難和其它型細(xì)胞區(qū)別。在一定的條件下，由于細(xì)胞密度增大聯(lián)成片后，可呈類似多角型或成纖維細(xì)膩包形態(tài)。常見于羊水細(xì)胞培養(yǎng)的早期。 五、培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)分析 培養(yǎng)細(xì)胞隨貼附支持物形狀不同而形態(tài)各異，最常見的是貼附于平面支持物細(xì)胞。在一般光鏡下生存中的細(xì)胞是均質(zhì)而透明的，結(jié)構(gòu)不明顯。細(xì)胞在生長期常有1-2個核仁在細(xì)胞機能狀態(tài)不良時，細(xì)胞輪廓會增強，反差增大。若胞質(zhì)中時而出現(xiàn)顆粒、脫滴和腔泡等，表明細(xì)胞代謝不良。 六、培養(yǎng)用品的清洗與消毒 目前我國細(xì)胞培養(yǎng)器皿主要仍使用能反復(fù)使用的玻璃器皿，清洗的主要目的為清除雜質(zhì)和微生物，使在器皿內(nèi)不殘留任何影響細(xì)胞生長的成份。因而在組織細(xì)胞培養(yǎng)中清洗和消毒是一項極為重要的環(huán)節(jié)。 （一） 清洗 在組織細(xì)胞培養(yǎng)中，體外細(xì)胞對任何有害物質(zhì)都非常敏感。微生物產(chǎn)品附帶雜物，上次細(xì)胞殘留物及非營養(yǎng)成分的化學(xué)物質(zhì)，均能影響培養(yǎng)細(xì)胞的生長。因此對新使用和重新使用的培養(yǎng)器皿都要嚴(yán)格徹底的清洗，且要根據(jù)器皿的組成材料不同，選擇不同的清洗方法。 1、玻璃器皿的清洗 組織細(xì)胞培養(yǎng)中，使用量最大的是玻璃器皿，故工作最最大的是玻璃器皿的清洗。一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、侵酸和沖洗四個步驟。清洗后的玻璃器皿僅要求干凈透明無油跡，而且不能殘留任何物質(zhì)。 （1）浸泡：初次使用和培養(yǎng)使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶液掉。新的初次使用的玻璃器皿，在生產(chǎn)及運輸過程中，玻璃表面帶有大量的干固的灰塵，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對細(xì)胞有害的物質(zhì)等。新瓶使用前應(yīng)先用自來水簡單刷洗，然后用稀鹽酸液（5）浸泡過夜，以中和其中的堿性物質(zhì)。再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過的蛋白質(zhì)，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上。 （2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的雜質(zhì)。刷洗要適度，過度會損害器皿表面光澤度。 （3）浸酸：清潔液是由重鉻酸鉀、濃硫酸和蒸餾水按一定比例配制而成，其處理過程稱為浸酸。清潔液對玻璃器皿無腐蝕作用，而其強氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質(zhì)。清潔液去污能力很強。是清洗過程中關(guān)鍵的一環(huán)。浸泡時器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面。浸泡時間一般為過夜，不應(yīng)少于6小時。 清潔液可根據(jù)需要，配制成不同的強度，常用的下列三種： 重鉻酸鉀（g） 濃硫酸（ml） 蒸餾水（ml） （A）強清潔液 63 1000 200000 B）次強清洗液 120 200 1000 （C）弱清潔液 100 100 100 清潔液配制時應(yīng)注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護好面部及身體裸露部分。配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制溶液應(yīng)選擇塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色。 （4）沖洗：玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗。使之盡量不留污染或潔液的殘跡。沖洗最好用洗滌裝置。即省力、效果又好。如用手工操作，則需流水沖洗十次以上，每天水須灌滿及倒干凈，最好用蒸餾水清洗3-5次，晾干備用。 2、膠塞的清洗 細(xì)胞培養(yǎng)中所用的橡膠制品主要是瓶塞。新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應(yīng)先用自來水沖洗，再做常規(guī)處理，常規(guī)清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2% NaOH或洗衣粉煮沸10-20分鐘，以除掉培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)。自來水沖洗后，再用1%稀鹽酸浸泡30分鐘或蒸餾水沖洗后再煮沸10-20分鐘，晾干備用。 3、塑料制品的清洗 塑料自制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的包裝，打開包裝即可用，多為一次性物品。必要時用2% NaOH浸泡過夜，用自來水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30分鐘，最后用自來水和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用。 （二）消毒 細(xì)胞培養(yǎng)的最大危險是發(fā)生培養(yǎng)物的細(xì)菌，真菌和病毒等微生物的污染，污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常見的原因有操作間或周圍空間的不潔，培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不徹底，由于有關(guān)培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)的失誤均能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，故細(xì)胞培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)都應(yīng)嚴(yán)格遵守操作常規(guī)，防止發(fā)生污染。 消毒方法分為三類： （A） 物理滅菌法（紫外線、濕熱、過渣等）。（B） 化學(xué)滅菌法（各種化學(xué)消毒劑）。（C） 抗生素。 （1）紫外線消毒：用于空氣，操作臺表面和不能使用其它法進(jìn)行消毒和培養(yǎng)器皿。紫外線直接照射方便、效果好，經(jīng)一定的時間照射后，可以消滅空氣中大部分細(xì)菌，培養(yǎng)室紫外線燈應(yīng)距地面不超過2.5米，且消毒進(jìn)物品不宜相互遮檔，照射不到的地方起不到消毒作用。 紫外線可產(chǎn)生臭氧，污染空氣，試劑及培養(yǎng)液都有不良影響，對人皮膚也有傷害，不宜近照射也進(jìn)行實驗操作。 （2）溫?zé)嵯荆杭锤邏赫魵庀?，是一種使用最廣泛、效果最好的消毒方法。溫?zé)嵯緯r，消毒物品不能裝得過滿，以防止消毒器內(nèi)氣體阻塞而千百萬危險，保證其內(nèi)氣體的流通。在加熱升壓之前，先要打開排氣閥門排放消毒器內(nèi)的冷空氣，冷氣空氣排出后，關(guān)閉排氣閥門，同時檢驗安全閥活動自如，繼后開始升壓，當(dāng)達(dá)到所需壓力時，開始記算消毒時間。消毒過程中，操作者不能離開工作崗位，要定時檢查壓力及安全，防止消毒及表皮意外事件發(fā)生。 常用物品消毒壓力及時間： 培養(yǎng)液、橡膠制品、10磅10分鐘； 布類、玻璃制品、金屬器械、18磅20分鐘。 上兩種是最常見的物理消毒方法。 （3）化學(xué)消毒法：最常見的是70%酒精及1‰的新潔而滅，前者主要用于操作者的皮膚，操作臺表面及無菌室內(nèi)的壁面處理。后者則主要用器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒?；瘜W(xué)消毒法操作簡單、方便有效。 （4）抗生素消毒：確切應(yīng)記成抗生素滅菌，主要用于培養(yǎng)用液滅菌或預(yù)防培養(yǎng)物污染。 七、絨毛染色體制備 絨毛來源于胚胎的中胚層，最早的初級干絨毛出現(xiàn)于孕三周初，孕8周左右是絨毛發(fā)育最旺盛時期。目前國內(nèi)外絨毛取材多選于8-9周。研究資料表明，絨毛取樣不影響胚胎的發(fā)育及胎盤的功能。但取樣的失敗可導(dǎo)致胚胎丟失而終止妊娠。 絨毛取樣前者首先要檢查陰道分泌物以判別陰道的潔凈度，防止取樣導(dǎo)致宮內(nèi)感染。其次需做B超檢查，一是確定胚胎大小，二是確定胚芽有無心血管搏動，三是確定胚芽在子宮內(nèi)的位置，用以判別取材時間，是否取材及取樣器進(jìn)宮的角度及深度。 1、實驗材料 婦科陰道沖洗物品、絨毛取樣器、5ml注射器、培養(yǎng)皿、小鑷子、5ml離心管、甲酸、檸檬酸鈉、冰乙酸、PMRI 1640、秋水仙素、載玻片等。 2、培養(yǎng)液配制 PRMI 1640 10-15ml 秋水仙素10ug/ml 1ml 3、 操作過程 （1）1‰新潔而滅沖洗陰道，用卵圓鉗固定子宮頸，根據(jù)婦查及B超提示選擇角度及濃度探性插入絨毛取樣器，當(dāng)有彈性阻擋感且深度符合B超所示時，抽出取樣器內(nèi)芯，接上5ml注射器，抽出4-5ml，此時，注射器內(nèi)可見有血性液體流進(jìn)； （2）取一干凈培養(yǎng)皿，內(nèi)加PRNI 1640 5ml，內(nèi)含秋水仙素0.06ug/ml。慢慢抽出取樣器，將所吸出物注入培養(yǎng)皿內(nèi)，并用1640沖洗注射器及取樣器，混勻。置培養(yǎng)箱30-40分鐘；（3）挑選發(fā)育良好的絨毛放入另一小培養(yǎng)皿中，用預(yù)溫37℃的0.075M。KCL與10%檸檬酸鈉1∶1混合液漂洗兩次。（4）用眼科小剪剪碎絨毛，再將2滴秋堿加入上途漂洗低滲液低滲30分鐘；（5）加3∶2的甲醇冰乙酸固定液0.2ml，預(yù)固定，1000rpm8分鐘，棄上清液；（6）加新鮮配制的3∶2固定液3ml；固定30分鐘，2000rpm8分鐘，棄上清液；（7）第二次固定可加3∶1甲醇冰乙酸固定液3ml固定30分鐘，2000rpm8分鐘，棄上清液；（8）離心后，加所余體積的60%冰乙酸，打勻，2分鐘后加等量甲醇，打勻，2000rpm8分鐘，棄上清液。（9）3m1 3∶1甲冰固定液過夜，冰水制片；（10）80℃考片2小時，自然冷卻。（11）G分帶處理，觀片。 八、羊水細(xì)胞培養(yǎng) 羊水中含有胎兒脫落的上皮細(xì)胞，可在體外培養(yǎng)用以分析胎兒染色體核型。目前國內(nèi)外大都采用腹腔羊膜穿刺術(shù)，妊娠12-30周的羊水細(xì)胞均可培養(yǎng)成功。羊膜腔穿刺取羊水行染色體分析，最佳孕周為16周左右。因此時羊水增長快，羊水中細(xì)胞較多，細(xì)胞培養(yǎng)易于生長，而且不易損傷胎兒。國內(nèi)多數(shù)選擇的穿刺時間在妊娠的第16-30周。國外現(xiàn)已較多地采用妊娠早期的羊膜穿刺，但需在B超下定位及穿刺。羊水量按妊娠時間大致計算（1ml/w）。資料表明，穿刺病例的妊娠結(jié)局、分娩方式、胎兒的出生體重等與未穿刺無明顯差異。 1、實驗材料 2.5%碘酒、75%酒精、無菌棉簽和棉球、鑷子、20-22號無菌腰穿針、吸管、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)液（PRMI 1640、199、F10、F12）、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、培養(yǎng)皿、蓋玻片等。 2、培養(yǎng)液配制 F-12 85% 小牛血清 15% 雙抗 100u/ml 小瓶貯藏 4-8℃ 3、操作過程 A（蓋玻片培養(yǎng)法） （1）采樣：選擇妊娠13-14周婦女，在無菌條件下抽取羊水5ml，立即注入無菌離心管中；（2）收集：離心分離細(xì)胞，1000rpm10分鐘，去上清，留0.5ml，輕打混勻；（3）接種：30mm培養(yǎng)皿中放蓋玻片1張，每片滴混勻的細(xì)胞液1-2滴，置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30-60分鐘；（4）培養(yǎng)：取出后從蓋玻片外加培養(yǎng)液2ml，靜置培養(yǎng)48小時后觀察細(xì)胞生殖狀況并定時換液，5-10天后，可見大量成纖維細(xì)胞或上皮樣細(xì)胞生長；（5）終止培養(yǎng)：當(dāng)有大量圓形發(fā)亮細(xì)胞出現(xiàn)時，加秋水仙素0.02-0.04ug/ml，作用10-12小時；（6）低滲：倒掉培養(yǎng)液，加預(yù)溫37℃0.075MKCL溶液5ml，37℃溫育30分鐘，鏡下可見脹大的羊水細(xì)胞，加0.5-1ml 3∶1甲醇：冰醋酸固定液預(yù)固定；（7）固定：倒掉低滲液，加5ml固定液固定30分鐘以上，反復(fù)3次；（8）干燥：將附有細(xì)胞的蓋玻片斜放于培養(yǎng)皿中，置80℃烤箱處理2-3小時；（9）膠片：將附有細(xì)胞的蓋玻片用樹脂膠封固于玻片上，正面朝外，小心細(xì)胞破壞； B（常規(guī)培養(yǎng)法） （1）—（2）相同于蓋玻片培養(yǎng)法；（3）接種：將混勻的羊水細(xì)胞種置于50ml或100ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，平均10ml羊水細(xì)胞收集的細(xì)胞種置一瓶加5-10ml混合培養(yǎng)液。（4）培養(yǎng)：酒精燈火先封口，靜置培養(yǎng)48小時后觀察細(xì)胞貼臂及生長情況，5-10天后可見瓶底面有大量羊水細(xì)胞生長；（5）終止培養(yǎng)：同A法；（6）細(xì)胞收集：將培養(yǎng)液倒入一干凈離心管中，加0.025%的胰蛋白酶0.5-1ml/瓶，輕輕搖動，使培養(yǎng)瓶底面完全接觸消化酶，然后用彎頭吸管吹打，待細(xì)胞全部脫落后加前培養(yǎng)液終止胰蛋白酶消化。用吸管移細(xì)胞懸液于離心管中。1000-2000rpm10分鐘，棄上清，留細(xì)胞沉慮。若一次消化不徹底，可反復(fù)消化；（7）低滲及預(yù)固定：加預(yù)溫37℃KCL溶液10ml，37℃溫育30分鐘，加0.5-1ml新鮮配制的3∶1甲醇冰乙酸固定液預(yù)固定，用氣泡吹打細(xì)胞使其混勻。（8）固定：用新鮮配制的3∶2甲冰固定三次，每次30分鐘。固定液加入時沿管壁緩慢加入；（9）制片及干燥：用絨毛制片；（10）分帶處理。 九、人外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng) 在正常情況下，人外周血中是沒有分裂相的，只有在異常情況下才能發(fā)現(xiàn)。植物血球凝集素（PHA）是人類淋巴細(xì)胞有絲分裂的刺激劑，在PHA作用下，原處于Go期的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，進(jìn)而進(jìn)行有絲分裂。利用PHA這一特性，淋巴細(xì)胞經(jīng)過含有HPA培養(yǎng)液培養(yǎng)，在體外便可獲得豐富的含有絲分裂的生長活躍的細(xì)胞群體，終止分裂中期的淋巴細(xì)胞，例可得到所需的人體染色體圖形。具有用血量少、操作簡單等優(yōu)點。 1、實驗材料 2.5%碘酒、75%酒精、無菌棉簽或棉球、鑷子、吸管、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)液（PRMI 1640、M199）、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、載玻片等。 2、培養(yǎng)液配制 無菌條件下配制培養(yǎng)液，每瓶所含下列試劑： RPMI 1640或199 90% 小牛血清 10% PHA（自制） 0.1ml 3% 肝素 10u/ml 2% 雙抗 100u/ml（選擇） 分裝于10ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶5ml培養(yǎng)液，封口置冷藏柜備用。 3、操作過程 （1）采樣接種：用2.5%碘酒、75%酒精消毒瓶蓋，用酒精燈火焰過烤，無菌條件下抽取患者外周血0.5-1ml，每瓶加20滴左右，輕搖均勻，盡量避免培養(yǎng)物與瓶蓋接觸；（2）培養(yǎng)：置36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，每隔12小時左右輕遙1次，以促進(jìn)細(xì)胞生長增殖；（3）抑止分裂：收獲前2小時左右加秋水仙素，最終濃度為0.02ug/ml培養(yǎng)液，搖勻后置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，以抑止細(xì)胞在分裂中期。（4）終止培養(yǎng)：從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，搖勻后移至10ml尖底離心管中，盡量收集培養(yǎng)細(xì)胞。2000rpm8分鐘。（5）低滲處理：棄上清液，加入預(yù)溫37℃的0.075MKCL8ml，迅速打勻，置37℃培養(yǎng)箱或水浴鍋中10-20分鐘；（6）預(yù)固定：取出低滲中尖底離心管，輕輕加入新配制的1-2ml 3∶2甲醇：冰乙酸混合液，取相應(yīng)編號滴管用汽泡輕輕軟打2-3下。800-1000rpm8-10分鐘；（7）固定：棄上清液。加入新鮮配制的3∶2甲醇冰乙酸混合液10ml，輕打混勻，封口置室溫30分鐘以上。1500-2000rpm10分鐘，反復(fù)2-3次；（8）制片：使用蒸餾水制備冰水片進(jìn)行滴片。留離心后沉淀細(xì)胞，加新鮮配制的固定液，制成細(xì)胞懸液，取1-2滴滴片，用于輕輕吹開?？烫柡笄謇砜烫栁畚?，置80℃烤片2小時；（9）收片：待烤箱自然冷卻后，取出烤片，置干凈環(huán)境中或培養(yǎng)箱中以備進(jìn)行顯帶處理。 十、植物油凝素的制備 植物血凝素也稱為植物凝集素（PHA），可自制也可購自商品。自制的方法常用生理鹽水提取法。 （A）干品制備法（1）選廣東雞子豆10g，用蒸餾水沖洗，置培養(yǎng)皿內(nèi)用75%酒精一次性浸洗，倒掉酒精留間隙置37℃。恒溫箱內(nèi)24-48小時；（2）在無菌條件下研碎雞子豆，加生理鹽水30ml，搖勻后放入4℃冰箱24小時，第二天再加生理鹽水70ml，再置4℃冰箱內(nèi)24小時。每8-12小時搖蕩一次。（也可一次性加100ml生理鹽水）；（3）無菌條件下移入10-50ml離心管內(nèi)，3000-4000rpm30分鐘。在無菌箱內(nèi)把上清液分裝于10ml小瓶，置冰箱冷凍層備用；（4）效價：外周血染色體制備每100ml培養(yǎng)基加PHA約2ml。注：若整個過程未在無菌條件下進(jìn)行，分裝時用G5玻砂漏斗除菌即可。 （B）鮮品制備法：（1）選擇完整無破皮鮮菜豆20g，用75%酒精浸泡10分鐘；（2）在凈化工作中用無菌鹽水或蒸餾水漂洗二次，然后置無菌乳缽中搗成糊狀，用100ml無菌鹽水浸泡封口；（3）移入4℃冰箱中置24小時，中間搖動數(shù)次，次日3000rpm30分鐘，在無菌情況下分裝上清液于10ml小瓶內(nèi)，置冰箱冷凍層備用。（4）效價：正式使用前先用一定量作效價測定，按效價使用。 十一、組織培養(yǎng)細(xì)胞染色體制備 組織細(xì)胞用于遺傳學(xué)分析最常見的是體外培養(yǎng)的細(xì)胞株，多為惡性腫瘤細(xì)胞株，且呈貼壁生長，僅小數(shù)細(xì)胞株為懸浮生長。培養(yǎng)細(xì)胞有來源易得、細(xì)胞分裂率高和染色體標(biāo)本制出清晰度高等優(yōu)點。組織細(xì)胞染色體制備的關(guān)鍵是掌握好體外細(xì)胞的生長動態(tài)，只有處在對數(shù)生長期的細(xì)胞才能出現(xiàn)較高的分裂相，所以積水仙素處理的時機及量是染色體標(biāo)本形態(tài)及分裂指數(shù)的關(guān)鍵。 1、實驗材料 培養(yǎng)液（PRMI 1640、M199、DMEM等），小牛血清、0.025%胰蛋酶、秋水仙素，刻度離心管，直吸管及彎頭吸管，培養(yǎng)瓶或皿、KCL、甲醇、冰乙酸、載玻片。 2、培養(yǎng)液配制 培養(yǎng)液 85-95% 小牛血清 5-15% 雙抗（選擇） 100u/ml 3、操作過程 （1）培養(yǎng)細(xì)胞：選擇處于指數(shù)生長期、用大瓶培養(yǎng)的80-90%匯合單層培養(yǎng)細(xì)胞； （2）終止培養(yǎng)：當(dāng)有大量圓形發(fā)亮細(xì)胞出現(xiàn)時，加秋水仙素0.01-0.03ug/ml培養(yǎng)混合液，置溫箱繼續(xù)培養(yǎng)6-10小時以抑制分裂期細(xì)胞停止于分裂中期；（3）聚集細(xì)胞： （A） 搖動法： 可利用分裂中期細(xì)胞變圓與底物附著不牢特點，此時可持培養(yǎng)瓶，左右反復(fù)橫向水平搖動，可使90%的中期分裂細(xì)胞從瓶壁脫落； （B） 消化法： 將培養(yǎng)液倒入離心管內(nèi)，給培養(yǎng)瓶內(nèi)加0.025%胰蛋白酶液0.5-1ml/瓶，水平左右搖動，便培養(yǎng)瓶底壁面完全接觸消化酶，稍后用彎頭吸管吹打，待細(xì)胞完全脫落后，加入3-5ml前培養(yǎng)終止消化。用吸管移入裝有培養(yǎng)液的離心管內(nèi)2000rpm10分鐘。棄上清液，留沉淀細(xì)胞； （4）低滲處理：給沉淀細(xì)胞加頂溫的37℃0.075MKCL8ml左右，用吸管打均勻，在溫箱中靜置20-30分鐘； （5）預(yù)固定：向低滲處理適當(dāng)?shù)碾x心管中加新鮮配制的3∶2甲醇，冰乙醇固定液1-2ml，用吸管輕松吹打調(diào)勻，此措施能起到使細(xì)胞表面輕微固定，可防止固定后細(xì)胞粘連成塊。 （6）固定：800-1000rpm10分鐘，棄上清液加新鮮配制的3∶2甲醇冰乙酸固定液10ml，加入時要沿管壁慢慢加入，后輕輕吹打，封口后室溫靜置30分鐘以上，反復(fù)三次； （7）制片：末次離心后，倒掉上清液，留沉淀細(xì)胞，加新鮮配制固定液0.5ml左右，混勻后冰片制片，其它同外周血方法。 十二、胸腹水細(xì)胞染色體制備 在惡性腫瘤的胸腹水中有大量的分裂期細(xì)胞，其中多以非整倍體細(xì)胞存在，并含有各種標(biāo)記染色體。 1、實驗材料 2.5%碘精、75%酒精、無菌棉球、鑷子20-22號無菌腰穿包、50ml離心管、秋水仙素、KCL、甲醇、冰乙酸、載玻片等。 2、操作過程 （1）采樣：選擇有胸或腹水患者，在無菌條件下，輕腹穿刺或于手術(shù)取胸或腹水20-50ml； （2）培養(yǎng)：立即加入秋水仙素培養(yǎng)，最終濃度為0.02-0.04ug/ml胸腹水，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)4-6小時； （3）低滲及后期制作羊水細(xì)胞。 十三、染色體制備體會 1、 培養(yǎng)基PH濃度、小牛血清量及培養(yǎng)箱溫度的恒定是培養(yǎng)成功關(guān)鍵； 2、秋水仙素適量、適宜的處理時機和時間，是獲得良好、足夠分裂相的條件。分裂相的多少和染色體形態(tài)及帶型處理良好與否均受其影響。 3、低滲處理是獲得分散良好的分裂相關(guān)鍵步驟，低滲過度或不足都會造成染色體形態(tài)不良的結(jié)果。在低滲處理時期細(xì)胞十分嬌嫩，并且表面發(fā)粘，低滲細(xì)胞混勻時，吹打要適宜，避免細(xì)胞破碎及粘團，另外不要將細(xì)胞吸到吸管上部及離心管上部，避免細(xì)胞丟失。 4、固定技術(shù)是制備良好分散的染色體的重要步驟。若染色體分?jǐn)?shù)不良，可適當(dāng)加大冰乙酸含量，其同時有改善由于低滲處理不夠或固定不充分所造成的缺陷，但過量會造成染色體形態(tài)變化和影響分帶結(jié)局。染色體形態(tài)不良與固定液速度有關(guān)，加第1次固定液過快或打過快，可造成飄帶樣染色體； 5、固定液每次使用必須新鮮配制，否則將會形成酯類，從而影響固定效果。6、滴片是染色體制備中影響染色體形態(tài)的關(guān)鍵一步。首先要載玻片要非常干凈，否則會影響染色體的分散和分帶效果。其次是滴片的距離、滴加量多少、制片的方式都會影響染色體分期效果。 7、烤片：是染色體制備中最后一步技術(shù)。烤片的溫度、時間與染色體形態(tài)和分帶有關(guān)。不宜溫度過高和烤片時間過長。 十四、染色體實驗技術(shù)分析 染色體分裂指數(shù)低：患者處于非常時期（感染期、放、化療期）： 培養(yǎng)基營養(yǎng)成份不良； 培養(yǎng)基PH偏低或偏高； PHA過量或不足； 小牛血清質(zhì)量不高； 小牛血清數(shù)量偏低或過高； 培養(yǎng)溫度不穩(wěn)定； 培養(yǎng)箱溫度偏低； 秋水仙素處理時間過短； 離心時間或速度不足； 制備過程損失過大。 染色體形態(tài)不理想：受檢者處于非常時期； PHA過量； 小牛血清質(zhì)量不高； 培養(yǎng)箱溫度不恒溫； 秋水仙素量不當(dāng)； 低滲時間不理想； 低滲溫度過高； 離心速度過高； 固定液加速過快； 固定混勻手法過重； 吹片技術(shù)不良。 染色體形態(tài)偏長： 培養(yǎng)基PH偏酸； 秋水仙素量偏低； 秋水仙素處理時間偏短； 染色體形態(tài)偏短： 培養(yǎng)基PH偏堿； 秋水仙紗處理量過量； 秋水仙素處理時間過長。 染色體分帶不良： 血液狀況不良； 培養(yǎng)基營養(yǎng)成分不良； 小牛血清質(zhì)量不高； 小牛血清數(shù)量不當(dāng)； 培養(yǎng)箱培養(yǎng)溫度不良； 秋水仙素處理量過高； PHA量過高； 低滲處理時間或溫度不良； 胰酶質(zhì)量不良； 染色液質(zhì)量不良； 染色技術(shù)不良； 分帶技術(shù)不佳。 染色背景不良： 培養(yǎng)細(xì)胞生長不良； 低滲處理技術(shù)不良； 離心過程塵染； 分帶技術(shù)不良； 染色技術(shù)不良； 染色液塵染； 載玻片處理不干凈； 制片過程塵染； 存片環(huán)境不干凈。 培養(yǎng)失?。? 培養(yǎng)中損失； 血源質(zhì)量不良； 培養(yǎng)中感染； 小牛血清污染； 培養(yǎng)箱溫度失控； PHA過期或過量； 秋水仙素失效； 低滲失敗； 離心機失誤。 標(biāo)本損失： 培養(yǎng)中損失； 制備中損失； 分帶中損失； 保存中損失； 十五、染色體分帶技術(shù) 染色體顯帶技術(shù)是在顯示染色體基礎(chǔ)上發(fā)展起來的技術(shù)，其優(yōu)點是能顯現(xiàn)染色體本身更細(xì)微的結(jié)構(gòu)，有助于更準(zhǔn)確地識別每條染色體及染色體異常疾病。染色體分帶技術(shù)能適用于各種細(xì)胞染色體標(biāo)本。 染色體顯帶是沿著整條染色體的長軸，能顯現(xiàn)出著色深淺不同、橫向走的帶型。目前認(rèn)為染色體顯帶現(xiàn)象是染色體結(jié)構(gòu)所致。但用特殊方法處理后，再用染料染色，則帶型更加清晰，隨顯帶方法不同，顯現(xiàn)出的帶型的特點也不一樣，這說明帶的出現(xiàn)與染料的特異結(jié)合相關(guān)。人類染色體能顯現(xiàn)出近2000個G帶，這些帶再融合成一般顯微鏡下可見的850條左右的高分辯染色體帶型或350條帶左右的常規(guī)帶型。 常見的顯帶方法： （一）、G帶 也稱為G顯帶，是最常用的顯帶方法，具有操作簡便、經(jīng)濟及標(biāo)本能長期保存等優(yōu)點。 1、Giemsa原液的配制： （1）稱3.75gGiemsa粉置研磨器中，加少許丙三醇研磨，研磨越細(xì)越好； （2）將研細(xì)的Giemsa加丙三醇移入500ml棕色瓶內(nèi)，丙三醇的總量為250ml，用一定量甲醇洗干凈研磨器。 （3）搖勻，置60℃水浴鍋24小時或37℃溫箱72小時，經(jīng)常搖動。 （4）取出冷卻后，加甲醇總量至250ml混勻，密封棕色瓶備用。貯藏時間越長，染色效果越好。 2、實驗材料： 中期染色體標(biāo)本； 0.9%氯化鈉注射水； 3%tris液體； 0.25%胰蛋白酶； Gremsa染色液； 蒸餾水； 水浴鍋； 立式染缸； 定時器或時針； 溫度計； 鑷子及紗布； 刻字筆； 3、操作程序： （1）消化液配制：取0.9%氯化鈉注射水100ml，加0.25%胰蛋白酶1ml，制成0.025%胰蛋白酶鹽水消化液，加4-5滴tris液調(diào)PH6.8左右，移消化液于立式染色缸并置37℃水浴鍋中備用； （2）染液配制：取立式染缸，加蒸餾水500ml，加3滴tris液調(diào)PH并加入Giemea染液1ml左右，用吸管調(diào)勻備用； （3）漂洗液：取立式染缸一個，內(nèi)加蒸餾水備用； （4）試消化：待消化液溫度在37℃左右時，取同批標(biāo)本較多者標(biāo)本1張，分二節(jié)或三節(jié)進(jìn)行消化，每節(jié)相差十五秒左右，從45秒或60秒開始增減。取出后先在紗布或吸水紙上直立除去帶出胰蛋白酶，后置蒸餾水染缸內(nèi)漂洗，取出后，標(biāo)本斜面朝上，刮去染色缸內(nèi)染液上浮膜，沿槽插入，每分鐘移動1次，染色3-5分鐘。 （5）洗片：從染色缸中取出標(biāo)本玻片，自來水沖洗，取刻編號面朝上用紗布干凈玻片背部染色，稍干，高倍鏡下觀片，確定分帶與染色時間。 （6）分帶：取4張待分帶標(biāo)本玻片，細(xì)胞面朝左側(cè)按順序插入37℃的消化液中，消化時間較試消化選擇時間延長5-10秒鐘，取出每片間隔時間約10秒鐘左右。 （7）消化及染色調(diào)整：每次消化完一批標(biāo)本后，需加入配好的消化液25ml于消化缸中，下次消化時間不變。同樣，每次染色一批標(biāo)本后加Giemsa染色液2-3滴，調(diào)勻，每次染色時間不變； （8）Giemsa染色調(diào)整：若Giemsa染色標(biāo)本偏紅，說明染色液偏酸，可加tris數(shù)滴調(diào)藍(lán)，若Gremsa染色標(biāo)本偏藍(lán)則說明tris加多了； （9）保存：將分好帶的及觀察中的標(biāo)本及時收集于玻片盒內(nèi)保存，防止細(xì)胞涂面灰塵污染及擦損。 注意：Giemsa消化染色過程中，有兩個重要的環(huán)節(jié)，一是胰酶消化環(huán)節(jié)，消化不足帶不出現(xiàn)，消化過度染色體變得膨脹和不著色，必須把握好胰酶濃度、消化時間和消化溫度；二是預(yù)處理或老化環(huán)節(jié)，對消化和帶型清晰度有很大影響，其中80℃2小時熱處理，是簡便易行和效果較好的辦法。 （二）姐妹染色單體分化染色 姐妹染色單體差別染色可使中期染色體顯示深淺不同的兩條單體，能借以觀察姐妹染色單體互換（SCE）現(xiàn)象。SCE是兩條染色單體在DNA合成中核苷酸序列發(fā)生互換而表現(xiàn)出來一種現(xiàn)象。即是細(xì)胞分裂是DNA同源重組的結(jié)果。SCE既是一種無害的變化（有生理波動），也可受射線、致突和致癌物三因素等作用而升高。SCE一定成度反映細(xì)胞的損傷與修復(fù)狀態(tài)。 1、原理： 在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，加入一定是的5-溴脫氧尿苷（BudR ）,當(dāng)細(xì)胞在DNA復(fù)制過程時，BudR能作為核苷酸的前體取代胸腺嘧啶而被摻入到新合DNA中。因此，當(dāng)細(xì)胞處于第二個分裂周期時，同一染色體的兩條姐妹染色單體，一條由雙股都含有BudR的DNA鏈構(gòu)成，而另一條為單股含有BudR的DNA鏈。在結(jié)構(gòu)上雙股含BudR的DNA螺旋化程度較低，故對染色劑親合力低，在用Giemsa染色時其單體著色淺，只有單股含BudR的DNA鏈組成的單體則著色深而形成差別著色。 2、BudR貯存液的配制： BudR 5mg（先用0.5ml 1N NaOH溶解） 然后加蒸餾水至 5ml 即成1000ug/ml的貯存液，因BudR遇光會發(fā)生分解，貯存液需置棕色瓶并黑紙封瓶避光冰凍保存。 3、實驗材料： 所檢培養(yǎng)細(xì)胞； BudR貯存液； 2×SSC液； 常規(guī)染色體制片所需物品； 水浴鍋； 20W紫外燈一個； 培養(yǎng)皿； 鏡頭紙； 4、操作程序 （1）BudR摻入：細(xì)胞培養(yǎng)24小時后于培養(yǎng)液中加入BudR，最終濃度5-15mg/ml，避光條件下繼續(xù)培養(yǎng)。 （2）終止培養(yǎng)：待細(xì)胞經(jīng)歷兩個細(xì)胞周期（48小時），培養(yǎng)終止前3小時加秋水仙素，秋水仙素終濃度為0.02ug/ml培養(yǎng)液； （3）常規(guī)制片及烤片； （4）紫外燈照射：取標(biāo)本玻片置于大號培養(yǎng)皿內(nèi)，正面朝上，上覆蓋鏡頭紙，從玻片外鏡頭紙邊沿加2×SSC液致使全鏡頭紙浸濕，移入50-60℃水浴鍋內(nèi)，紫外線燈距離5cm，照射30-40分鐘； （5）染色：取出照射后標(biāo)本，蒸餾水沖洗，置PH6.8的2%Giemsa染色15分鐘； （6）洗片及存片：同G帶片 注意：BudR是一種強突變劑，使用濃度不宜過高，否則會產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。 （三）染色體脆性部位（fra） 脆性位點也稱危性部位，是在一定的培養(yǎng)條件下人類染色體上某些特異位點非隨機地表現(xiàn)出的裂隙和斷裂。脆性部位分為普通型和罕見型兩大類。 1、實驗材料 （1）常規(guī)外周血所用物品。 （2）培養(yǎng)基是用不含葉酸的MEM-Fra培養(yǎng)基或低葉酸的CT199培養(yǎng)基。 2、培養(yǎng)液配制 MEM-Fra 90-95% 小牛血清 5-10% 雙抗 100u/ml PH調(diào)至7.5左右 3、操作程序 與制備外周血的染色體方法相同。 注：脆性X綜合癥：（FraX） 這種染色體改變是在1969年被發(fā)現(xiàn)，1977年被定位于Xq27、記錄為fra（X）（q），并命名為脆性部位。X連鎖智力低下（MR）與fra（X）（q27）密切相關(guān)。FraX的發(fā)生率占新生兒的1/2500；占X連鎖MR病1/2-1/3；占男性MR的1-2%；其發(fā)生率僅次于先天愚型。 |
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