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| 購(gòu)買進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 kjhfd.cn |
胚胎冷凍儀http://kjhfd.cn/a/gb2312/yiqi/CryoLogic/2010/0428/3073.html 程序降溫儀http://kjhfd.cn/a/gb2312/yiqi/CryoLogic/2013/0904/5082.html 胚胎冷凍程序及方法 要點(diǎn) •胚胎冷凍效果依賴于體外受精的成功率。如果新鮮胚胎的體外受精的效果不好，冷凍效果也會(huì)不好。 •成功的胚胎冷凍需要穩(wěn)定精確的冷凍儀器，形態(tài)良好的胚胎及配子，以及精細(xì)的實(shí)驗(yàn)室操作。 儀器及耗材清單 1 程序冷凍儀 2 液氮儲(chǔ)存罐:用于保存人的胚胎或細(xì)胞。 3 麥管或塑料冷凍管:無毒、無菌、質(zhì)量?jī)?yōu)良。 4 冷凍及解凍液:FREEZE-KIT1/THAW-KIT1 (含有丙二醇)。FREEZE-KIT2/THAW-KIT2(含甘油與蔗糖)。 5 液氮使用量的多少由冷凍儀的類型以及儲(chǔ)存罐的大小決定。 應(yīng)在對(duì)細(xì)胞造成最小損害的情況下對(duì)其進(jìn)行冷凍與解凍。細(xì)胞冷凍就是使用冷凍保護(hù)劑將細(xì)胞脫水以防止或減少在冷凍過程中發(fā)生細(xì)胞損傷。選擇適宜的溫度梯度將會(huì)有利于細(xì)胞的冷凍，同時(shí)還會(huì)使細(xì)胞最大程度脫水。在冷凍過程使用冷凍保護(hù)劑，將會(huì)降低細(xì)胞由于冷凍液的高滲透壓及較高濃度而造成的危害。 不同的胚胎發(fā)育階段需要不同的冷凍保護(hù)劑。1,2-丙二醇是原核卵與早期胚胎冷凍最常用的冷凍液，而囊胚期胚胎則常用甘油。冷凍及解凍過程的順利與否是細(xì)胞能否存活的關(guān)鍵，而在液氮里儲(chǔ)存胚胎則不會(huì)對(duì)其產(chǎn)生有害作用。 首先將胚胎放人冷凍保護(hù)劑中然后再放進(jìn)麥管。接著用生理冷凍儀精確地降低麥管的溫度。在冷凍液接近冰點(diǎn)時(shí)用液氦冷凍過的鑷子誘導(dǎo)麥管液體結(jié)晶。該過程又稱為植冰或冰核形成。如果不進(jìn)行植冰或者植冰不充分，那么胚胎將會(huì)由于脫水不完全以及發(fā)生自植冰而遭受一定的損害。胚胎外植冰是胚胎脫水是否完全的關(guān)鍵點(diǎn)。 隨著胚胎外無滲透能力溶劑濃度的增加以及胚胎外水分的結(jié)晶，胚胎內(nèi)水分將會(huì)不斷脫出脫水過程一直持續(xù)到胚胎達(dá)到冰點(diǎn)。如果冷凍過程太快胚胎脫水將會(huì)不完全。 如果胚胎解凍太慢，在緩慢升溫過程中超冷水將會(huì)在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生結(jié)晶從而損害胚胎。胚胎解凍的速度一般由冷凍劑的類型及-40℃以下的冷凍速率所決定。如果胚胎冷凍過程較快(例如緩慢冷凍到-40℃)，那么解凍速率也要快(直接放人30℃溫水中，500℃/分)。如果冷凍過程較慢(例如緩慢冷凍到-80℃)，那么解凍速率必須為10℃/分。丙二醇及甘油都需要快速解凍。 FREEZE-KITTM/THAW-KIT1TM 該方法可用于從原核階段的卵子到8細(xì)胞胚胎的冷凍TM，該方法由TESTART 1986年的冷凍方法改進(jìn)而來，使用丙二醇作為滲透性冷凍保護(hù)劑。蔗糖為非滲透性冷凍保護(hù)劑。蔗糖是一種能夠促使細(xì)胞脫水的生物大分子，而且還能夠在胚胎解凍時(shí)防止細(xì)胞溶解。因?yàn)楦鱾€(gè)步驟都是在培養(yǎng)箱外室溫下進(jìn)行的，因而須用磷酸鹽緩沖液穩(wěn)定PH波動(dòng)。 FREEZE-KIT1TM成分： Cryo-PBS: PBS+25mg/ml HSA 溶液1(FS1):1.5M丙二醇+ Cryo-PBS 溶液2(FS2):1.5M丙二醇+0.1M蔗糖+ Cryo-PBS 冷凍程序舉例 起始溫度 18℃ 第一步 -2.0 ℃到–7.0℃ 第二步 -7.0℃停留10分鐘，2分鐘后植冰(seeding) 第三步 -0.3℃到-30.0℃ 第四步 -30.0℃到 -80.0℃ -1℃(至少10.0℃/分) 將麥管拿出并放進(jìn)液氮罐中(為于液面以下，不要位于汽相)儲(chǔ)存。 要點(diǎn) • 因?yàn)榕咛ソ鈨鲑|(zhì)量與胚胎起始質(zhì)量密切相關(guān)，因此冷凍保存的必須是高質(zhì)量胚胎。 • 在冷凍操作開始之前要仔細(xì)檢查患者身份并且準(zhǔn)備冷凍記錄。 冷凍操作步驟 1 準(zhǔn)備適當(dāng)體積的冷凍液Cryo-PBS、FS1及FS2，并室溫平衡。 2 將胚胎放入Cryo-PBS，觀察并記錄詳細(xì)的形態(tài)變化(2-5分鐘)。 3 然后將胚胎緩緩放入FS1保持10分鐘(不要超過20分鐘)。胚胎將會(huì)發(fā)生皺縮，隨即又會(huì)達(dá)到平衡。 4 將胚胎放入FS2，然后用1ml注射針接到麥管上并將胚胎放入麥管。拿出麥管封口以防液氮漏入。 5 將麥管放進(jìn)冷凍儀，開始冷凍程序。 6 -7.0℃時(shí)用液氮浸透過的棉簽在接近麥管上部的部位進(jìn)行植冰。一定不要在接近胚胎的部位植冰。不要將麥管拿出或者搖動(dòng)。如果植冰部位有氣泡胚胎的存活率將會(huì)下降。繼續(xù)冷凍程序。 7 整個(gè)冷凍程序大約需要2小時(shí)，必須注意麥管低溫時(shí)極易發(fā)生解凍。將麥管放入液氮罐，-196℃保存。 THAW-KIT1TM成份： 溶液1(TS1):1.0M丙二醇+ 0.2M蔗糖+Cryo-PBS 溶液2(TS2):0.5M丙二醇+0.2M蔗糖+ Cryo-PBS 溶液3(TS3):0.2M蔗糖+ Cryo-PBS 要點(diǎn) • 解凍麥管時(shí)必須一次成功。 • 解凍操作在室溫下進(jìn)行(18-20℃) • 確認(rèn)患者身份并進(jìn)行記錄。 解凍操作步驟 1 確認(rèn)患者身份找出相應(yīng)麥管，并進(jìn)行記錄。將解凍液器皿上標(biāo)上記號(hào)TS1，TS2，TS3及Cryo-PBS。 2 拿出麥管室溫下解凍30秒。室溫解凍時(shí)必須仔細(xì)檢查麥管內(nèi)是否有氣泡、裂痕或者液氮滲漏。 3 將麥管放進(jìn)30℃水中浴30秒。拿出小心擦干。消毒剪去一端，接上1ml注射器。然后剪去另一端，注意不要晃動(dòng)以免造成氣泡。 4 小心地將胚胎吹入TS1中。觀察胚胎是否從麥管中被吹了出來，如果沒被完全吹出來，應(yīng)當(dāng)吸取一點(diǎn)液體再次。胚胎可能會(huì)偶爾黏附在麥管壁上。 5 在TS1中孵育5分鐘。 6 小心地將胚胎移入TS2保持5分鐘。 7 移入TS3中5-10分鐘。滲透壓變化使質(zhì)膜變脆弱。 8 將胚胎放進(jìn)室溫Cryo-PBS，接著放入37℃器皿中保持10分鐘。不要放入二氧化碳培養(yǎng)箱，因?yàn)镃ryo-PBS對(duì)5%CO2的緩沖能力不足。 9 然后可以將胚胎放入IVFTM、G1.2TM或者G2.2TM中。檢測(cè)胚胎存活率并評(píng)價(jià)胚胎形態(tài)。這時(shí)的胚胎可以立即進(jìn)行移植，也可以在培養(yǎng)一段時(shí)間后移植。原核卵子應(yīng)當(dāng)在IVFTM或者G1.2TM中培養(yǎng)過夜，如果分裂正常才能進(jìn)行移植。 10 解凍操作過程對(duì)胚胎冷凍成功與否也極為關(guān)鍵。確保在適宜的時(shí)間將胚胎移植進(jìn)入受體子宮。冷凍胚胎既可以在自然周期，在可以在人工周期移植。 FREEZE-KIT2TM/THAW-KIT2TM FREEZE-KIT2TM/THAW-KIT2TM-冷凍/解凍法該方法由HARSHORNE等人的方法改編而來，用于囊胚的冷凍。 FREEZE-KIT2TM成份： Incubation 1%的甘油 2%的甘油 4%的甘油 6%的甘油 8%的甘油 冷凍程序舉例 第一步 從室內(nèi)環(huán)境溫度至-7℃，溫度下降速率為1℃/分。 第二步 在-7℃停留5分鐘并植冰(seeding)。 第三步 從-7℃慢慢降溫至-30℃，溫度下降率為0.3℃/分。 第四步 從-30℃迅速降溫至約-150℃。 第五步 將麥管立即投入液氮罐(-196℃) 要點(diǎn) • 因?yàn)榕咛ソ鈨鲑|(zhì)量與胚胎起始質(zhì)量密切相關(guān)，因此冷凍保存的必須是高質(zhì)量胚胎。 • 在冷凍操作開始之前要仔細(xì)檢查患者身份并且準(zhǔn)備冷凍記錄。 冷凍操作步驟： 1 檢查并啟動(dòng)冷凍儀CL8800。 2 準(zhǔn)備六個(gè)FALCON或者幾個(gè)四孔皿，依次標(biāo)記Incubation、1%、2%、4%、6%、及8%。 3 在各孔中依次加入適量的冷凍液。 4 將培養(yǎng)皿在37℃及5%CO2條件下平衡1小時(shí)。步驟5-10的培養(yǎng)條件與此相同。 5 將胚胎移入Incubation中孵育5分。 6 將胚胎移入1%的甘油不孵育10分。 7 將胚胎移入2%的甘油不孵育10分。 8 將胚胎移入4%的甘油不孵育10分。 9 將胚胎移入6%的甘油不孵育10分。 10 將胚胎移入8%的甘油不孵育10分。 11 用1mL注射針管將懸浮于8%冰凍液中的胚胎吸入麥管。冷凍液會(huì)浸入石棉塞，并會(huì)使其膨脹以堵住麥管。另一端封口，可用鑷子燒熱將麥管另一端熱融封口。 12 拿出麥管熱封，貼上標(biāo)簽裝入冷凍儀。 13 立即啟動(dòng)冷凍程序。 14 在-7℃，用液氮冷凍的鑷子植冰或用棉簽在程序降溫儀液氮浴桶內(nèi)蘸少許液氮進(jìn)行植冰。 15 繼續(xù)執(zhí)行冷凍程序，最后快速拿出麥管移入液氮。 16 然后將麥管放入儲(chǔ)存罐。 THAW-KIT 2TM 成份： 8%的甘油 6%的甘油 5%的甘油 4%的甘油 3%的甘油 2%的甘油 1%的甘油 Incubation 要點(diǎn) 一次解凍一支麥管 確認(rèn)患者身份并進(jìn)行記錄 解凍操作步驟： 1準(zhǔn)備九個(gè)FALCON培養(yǎng)皿或者幾個(gè)四孔皿，依次標(biāo)記8%、6%、5%、4%、3%、2%、1%和兩個(gè)Incubation皿。 2吸取適當(dāng)體積的解凍液。另外準(zhǔn)備一個(gè)G2.2TM或CCMTM培養(yǎng)皿。 3在37℃與5%CO2條件下平衡1小時(shí)。 4用37℃溫水裝滿一個(gè)大燒杯。 5將麥管迅速?gòu)膬?chǔ)存罐中取出，放進(jìn)盛有液氮的容器，再次檢查患者身份。 6從液氮中拿出麥管，用紗布迅速擦干并開始記時(shí)。用帶有標(biāo)記的鑷子持住麥管在空氣中解凍30秒。觀察麥管是否漏液。 7將麥管輕輕放進(jìn)30℃溫水中孵育40-50秒。 8拿出麥管，用紗布擦干，然后用剪斷麥管熱封一端，接上注射針管。剪斷石棉封口端，將囊胚推注到8%冰凍液中。如果沒有胚胎，應(yīng)再次沖冼麥管。將胚胎在8%甘油中放置5分鐘。 9將胚胎轉(zhuǎn)移到6%甘油中，并在37℃5%CO2條件下孵育10分。步驟10-14的培養(yǎng)條件與此相同。 10將胚胎轉(zhuǎn)移到5%甘油中孵育12分。 11將胚胎轉(zhuǎn)移到4%甘油中孵育12分。 12將胚胎轉(zhuǎn)移到3%甘油中孵育12分。 13將胚胎轉(zhuǎn)移到2%甘油中孵育12分。 14將胚胎轉(zhuǎn)移到1%甘油中孵育12分。 15用Incubation沖冼胚胎兩次。 16將胚胎移入G2.2TM或CCMTM培養(yǎng)皿中，在37℃5%CO2條件下孵育一時(shí)間。 17在顯微鏡下評(píng)估胚胎質(zhì)量，并與未冷凍時(shí)的胚胎形態(tài)進(jìn)行對(duì)比。 18培養(yǎng)胚胎直至移植日為止。 解凍步驟：①?gòu)囊旱拗腥〕鳆湽?，室溫?nbsp;40 秒(溫度上升 300 ℃ /min ) ,用紙擦去麥管外面的冰;②麥管放入 30 ℃水中一分鐘，見溶液中冰已融化;③取下塑料棒，剪去塑料塞，使F3 中胚胎流入 T1 放置 5 分鐘;④轉(zhuǎn)移胚胎到 T25 分鐘， T35 分鐘， T45分鐘。這樣令冷凍保護(hù)劑 PROH 及 Sucrose 逐步脫掉;⑤在培養(yǎng)液中洗 2 次后，將放入培養(yǎng)液中，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 2 小時(shí)以后移植。 Seeding 常徒手操作，采用在液氮中浸泡過的鑷子頭迅速夾麥管中裝有胚胎的 F3 液段，誘發(fā)結(jié)冰。在 -7 ℃須停留 7-10 分鐘使全部液體結(jié)冰。 CL-8800型程序冷凍儀是當(dāng)溫度降到-7℃時(shí)用液氮冷凍的鑷子植冰或用棉簽在程序降溫儀液氮浴桶內(nèi)蘸少許液氮進(jìn)行植冰。
胚胎冷凍儀http://kjhfd.cn/a/gb2312/yiqi/CryoLogic/2010/0428/3073.html 程序降溫儀http://kjhfd.cn/a/gb2312/yiqi/CryoLogic/2013/0904/5082.html |
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