0 引言
隨著分子生物學(xué)研究尤其是人類基因組計(jì)劃的迅速發(fā)展,大量關(guān)于基因結(jié)構(gòu)的信息不斷涌現(xiàn),對(duì)這些信息進(jìn)行系統(tǒng)研究以了解新基因功能的要求也日益迫切.這不僅需要利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行生物信息學(xué)的分析和預(yù)測(cè),而且必須結(jié)合生物學(xué)實(shí)驗(yàn)獲取證據(jù).為適應(yīng)同時(shí)對(duì)多個(gè)基因或蛋白進(jìn)行研究的發(fā)展趨勢(shì),已出現(xiàn)了很多新技術(shù),如DNA微陣列技術(shù)（DNA micoarry）,基因表達(dá)的系列分析（SAGE）,肽質(zhì)譜分析法,蛋白雙向膠電泳技術(shù)及酵母雙雜交技術(shù)（Yeast Two-Hybrid System）等.其中酵母雙雜交技術(shù)以其簡(jiǎn)便,靈敏,高效以及能反映不同蛋白質(zhì)之間在活細(xì)胞內(nèi)的相互作用等特點(diǎn)在基因功能的研究中得到了廣泛的應(yīng)用.
1 酵母雙雜交技術(shù)的基本原理
1989年,Song和Field建立了第一個(gè)基于酵母的細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)蛋白間相互作用的遺傳系統(tǒng)〔1〕.很多真核生物的位點(diǎn)特異轉(zhuǎn)錄激活因子通常具有兩個(gè)可分割開(kāi)的結(jié)構(gòu)域,即DNA特異結(jié)合域（DNA-binding domain,BD）與轉(zhuǎn)錄激活域（Transcriptional activation domain ,AD）.這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能,互不影響.但一個(gè)完整的激活特定基因表達(dá)的激活因子必須同時(shí)含有這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,否則無(wú)法完成激活功能.不同來(lái)源激活因子的BD區(qū)與AD結(jié)合后則特異地激活被BD結(jié)合的基因表達(dá).基于這個(gè)原理,可將兩個(gè)待測(cè)蛋白分別與這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域建成融合蛋白,并共表達(dá)于同一個(gè)酵母細(xì)胞內(nèi).如果兩個(gè)待測(cè)蛋白間能發(fā)生相互作用,就會(huì)通過(guò)待測(cè)蛋白的橋梁作用使AD與BD形成一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄激活因子并激活相應(yīng)的報(bào)告基因表達(dá).通過(guò)對(duì)報(bào)告基因表型的測(cè)定可以很容易地知道待測(cè)蛋白分子間是否發(fā)生了相互作用.
酵母雙雜交系統(tǒng)由三個(gè)部分組成：(1)與BD融合的蛋白表達(dá)載體,被表達(dá)的蛋白稱誘餌蛋白(bait).(2)與AD融合的蛋白表達(dá)載體,被其表達(dá)的蛋白稱靶蛋白(prey).(3)帶有一個(gè)或多個(gè)報(bào)告基因的宿主菌株.常用的報(bào)告基因有HIS3,URA3,LacZ和ADE2等.而菌株則具有相應(yīng)的缺陷型.雙雜交質(zhì)粒上分別帶有不同的抗性基因和營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因.這些有利于實(shí)驗(yàn)后期雜交質(zhì)粒的鑒定與分離.根據(jù)目前通用的系統(tǒng)中BD來(lái)源的不同主要分為GAL4系統(tǒng)和LexA系統(tǒng).后者因其BD來(lái)源于原核生物,在真核生物內(nèi)缺少同源性,因此可以減少假陽(yáng)性的出現(xiàn).
2 酵母雙雜交技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀
酵母雙雜交技術(shù)產(chǎn)生以來(lái),它主要應(yīng)用在以下幾方面：(1）檢驗(yàn)一對(duì)功能已知蛋白間的相互作用.(2）研究一對(duì)蛋白間發(fā)生相互作用所必需的結(jié)構(gòu)域.通常需對(duì)待測(cè)蛋白做點(diǎn)突變或缺失突變的處理.其結(jié)果若與結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究結(jié)合則可以極大地促進(jìn)后者的發(fā)展.(3)用已知功能的蛋白基因篩選雙雜交cDNA文庫(kù),以研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑.(4)分析新基因的生物學(xué)功能.即以功能未知的新基因去篩選文庫(kù).然后根據(jù)釣到的已知基因的功能推測(cè)該新基因的功能.
3 常見(jiàn)問(wèn)題的解決與改進(jìn)
酵母雙雜交系統(tǒng)應(yīng)用中常遇到的問(wèn)題一是假陽(yáng)性較多,二是轉(zhuǎn)化效率偏低.所謂假陽(yáng)性就是:在待研究的兩個(gè)蛋白間沒(méi)有發(fā)生相互作用的情況下,報(bào)告基因被激活.主要原因是由于BD融合誘餌蛋白有單獨(dú)激活作用,或者這種融合蛋白的激活作用被外來(lái)蛋白激活.另外AD融合靶蛋白如果有DNA的特異性結(jié)合,則也可單獨(dú)激活報(bào)告基因的表達(dá).因此,為排除假陽(yáng)性就需要作嚴(yán)格的對(duì)照試驗(yàn).應(yīng)對(duì)誘餌和靶蛋白分別作單獨(dú)激活報(bào)告基因的鑒定.目前幾個(gè)公司推出的酵母雙雜系統(tǒng)都采用了多個(gè)報(bào)告基因,且每個(gè)報(bào)告基因的上游調(diào)控區(qū)各不相同,這可減少大量的假陽(yáng)性.另外,報(bào)告基因通常整合到染色體上,可以使基因表達(dá)水平穩(wěn)定,消除了由于質(zhì)?？截悢?shù)變化引起基因表達(dá)水平波動(dòng)而造成的假陽(yáng)性.即使根據(jù)嚴(yán)格的對(duì)照實(shí)驗(yàn)證明確實(shí)發(fā)生了蛋白間的相互作用,還應(yīng)對(duì)以下方面進(jìn)行分析：
(1)這種相互作用是否會(huì)在細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生,即這一對(duì)蛋白在細(xì)胞的正常生命活動(dòng)中是否會(huì)在同一時(shí)間表達(dá)且定位在同一區(qū)域.
（2)某些蛋白如是依賴于遍在蛋白的蛋白酶解途徑的成員,它們具有普遍的蛋白間的相互作用的能力.
（3)一些實(shí)際上沒(méi)有任何相互作用的但有相同的模體(motif)如兩個(gè)親a-螺旋的蛋白質(zhì)間可以發(fā)生相互作用.十年來(lái),酵母雙雜交技術(shù)一直在消除假陽(yáng)性方面不斷改進(jìn),并且已取得較好的效果〔2,3〕.
在酵母雙雜交的應(yīng)用中有時(shí)也會(huì)遇到假陰性現(xiàn)象.所謂假陰性,即兩個(gè)蛋白本應(yīng)發(fā)生相互作用,但報(bào)告基因不表達(dá)或表達(dá)程度甚低以至于檢測(cè)不出來(lái)〔4〕.造成假陰性的原因主要有兩 方面：一是融合蛋白的表達(dá)對(duì)細(xì)胞有毒性.這時(shí)應(yīng)該選擇敏感性低的菌株或拷貝數(shù)低的載體.二是蛋白間的相互作用較弱,應(yīng)選擇高敏感的菌株及多拷貝載體.目前假陰性現(xiàn)象雖不是實(shí)驗(yàn)中的主要問(wèn)題,但也應(yīng)予以重視.
轉(zhuǎn)化效率是酵母雙雜交文庫(kù)篩選時(shí)成敗的關(guān)鍵之一,特別是對(duì)低豐度cDNA庫(kù)進(jìn)行篩選時(shí),必須提高轉(zhuǎn)化效率.轉(zhuǎn)化時(shí)可采用共轉(zhuǎn)化或依次轉(zhuǎn)化,相比之下共轉(zhuǎn)化省時(shí)省力.更重要的是如果單獨(dú)轉(zhuǎn)化會(huì)發(fā)生融合表達(dá)蛋白對(duì)酵母細(xì)胞的毒性時(shí),共轉(zhuǎn)化則可以減弱或消除這種毒性.一種更有效的方法是將誘餌蛋白載體與靶蛋白載體分別轉(zhuǎn)入不同接合型的單倍體酵母中,通過(guò)兩種接合型單倍體細(xì)胞的雜交將誘餌蛋白與靶蛋白帶入同一個(gè)二倍體細(xì)胞.
目前很多機(jī)構(gòu)建立了大量的cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù),但這些文庫(kù)大多無(wú)法直接用于雙雜交系統(tǒng)的篩選.而文庫(kù)的質(zhì)量對(duì)于轉(zhuǎn)化和篩選又非常關(guān)鍵.因此,大量構(gòu)建適用于酵母雙雜交的文庫(kù)非常必要.現(xiàn)已出現(xiàn)一種采用體內(nèi)重組技術(shù)來(lái)達(dá)到這個(gè)目的的方法〔5〕.
4 酵母雙雜交技術(shù)的新發(fā)展
酵母雙雜交技術(shù)在應(yīng)用中發(fā)揮了巨大的作用,但人們也注意到了它有一定的局限性.為此發(fā)展了多種適應(yīng)不同目的需要的改型的雙雜交技術(shù).
反向雙雜交技術(shù) 在研究中檢測(cè)并鑒定出那些能阻斷兩個(gè)蛋白間相互作用的因素有重要意義.在研究那些能使相互作用被阻斷的因素(如尋找哪些結(jié)構(gòu)域上發(fā)生突變可使相互作用中斷或那些分子可以阻斷相互作用)時(shí),傳統(tǒng)的雙雜交技術(shù)有較大的局限性.因此,反向雙雜交系統(tǒng)(Reverse Two-Hybrid System)應(yīng)運(yùn)而生〔6,7〕.這項(xiàng)技術(shù)的特點(diǎn)是采取了反選擇篩選策略.根據(jù)反選擇設(shè)計(jì)的不同,大致可以分為兩類.一類是用便于反選擇的URA3或CYH2基因作為報(bào)告基因.URA3基因編碼尿嘧啶合成途徑中的重要酶：乳清酸核苷5’-磷酸脫羧酶,它能把5’-氟乳清酸（5’-FOA）轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性物質(zhì), 使細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng).反之,在能生長(zhǎng)的細(xì)胞中,外界因素已使蛋白間的相互作用不能發(fā)生,而我們想知道的正是這些因素.因此,只要對(duì)存活的克隆進(jìn)行檢測(cè)就可以得到結(jié)果. Vidal等人用這種技術(shù)發(fā)現(xiàn)了影響轉(zhuǎn)錄因子E2F1中與DP1相互作用必需區(qū)內(nèi)的點(diǎn)突變〔9〕.另一類是將常規(guī)報(bào)告基因(如HIS3)置于大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn10編碼的tet-抑制因子(TetR)/操縱基因控制之下.待測(cè)蛋白之間發(fā)生相互作用后首先激活tet-R基因表達(dá)抑制因子TetR,TetR結(jié)合到tet操縱基因后就抑制了報(bào)告基因的表達(dá),結(jié)果轉(zhuǎn)化子不能生長(zhǎng).只有當(dāng)待測(cè)蛋白之間的相互作用被某種因素所阻斷而無(wú)法激活tet-R基因時(shí),報(bào)告基因才能擺脫tet操縱基因的控制而表達(dá),使轉(zhuǎn)化子獲得在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的能力.Shih 等人利用這種方法鑒定出cAMP-應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)中磷酸化位點(diǎn)的Ser133突變會(huì)阻斷其與輔助激活因子(CREB結(jié)合蛋白)的相互作用〔8〕.
三雜交技術(shù) 在許多細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞過(guò)程中,兩個(gè)蛋白間的相互作用常涉及到其它的大分子.如蛋白,激酶,RNA,多肽及其它大分子.在研究這些大分子對(duì)蛋白間相互作用的影響過(guò)程中發(fā)展了一種新的技術(shù)系統(tǒng)——三雜交系統(tǒng)(Three-Hybrid System),其本質(zhì)與雙雜交是相同的,只是需通過(guò)第三個(gè)分子的介導(dǎo)把兩個(gè)雜交蛋白帶到一起〔9〕.例如小配體三雜交系統(tǒng)(Small Ligand Three-Hybrid System)是利用可以滲透的二聚體化學(xué)誘導(dǎo)物(Chemical Inducers of Dimerization,CIDs)作橋梁,將AD和BD融合蛋白連接到一起,激活報(bào)道基因的表達(dá).研究較多的是免疫抑制劑FK506〔10〕.Belshaw等將FK506與環(huán)孢菌素A(Cyclosporin A)構(gòu)建成異源二聚體,它能把分別與FK506和環(huán)孢菌素A有相互作用的AD和BD融合蛋白拉倒一起,激活報(bào)告基因〔11〕.Licitra將FK506與地米塞松(dexamethasone )通過(guò)共價(jià)鍵連接成二聚體.通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了FK506與蛋白FKBP-12間的特異性相互作用〔12〕,表明用這種方法鑒定蛋白與小分子間的相互作用是切實(shí)可行的.RNA與蛋白之間的相互作用是許多細(xì)胞生命活動(dòng)的基礎(chǔ),例如mRNA的翻譯,早期發(fā)育以及RNA病毒的感染等.然而可用于這方面研究的簡(jiǎn)便方法卻很少.RNA三雜交系統(tǒng)(RNA Three-Hybrid System)的建立為分析RNA與蛋白之間的相互作用提供了有效的手段.這個(gè)系統(tǒng)主要是由一個(gè)RNA分子和兩個(gè)都能結(jié)合該RNA的蛋白質(zhì)組成.此RNA的一部分與一個(gè)已知蛋白結(jié)合后就可利用它的另一部分去篩選新的RNA結(jié)合蛋白.因此這種技術(shù)既可檢測(cè)由RNA介導(dǎo)的兩個(gè)蛋白質(zhì)之間的相互作用,也可篩選鑒定新的蛋白結(jié)合RNA.Putz等把HIV-1病毒Rev蛋白的突變體RevM10與Gal4 DB域融合作為誘餌蛋白,利用該RevM10蛋白能識(shí)別并結(jié)合其靶RNA中Rev蛋白反應(yīng)元件(Rev responsive element,RRE)的作用去篩選同樣也能與此RNA結(jié)合并已與Gal4 AD域融合的未知蛋白.根據(jù)同樣的原理,如將一個(gè)已知RNA與RRE融合形成雜合RNA分子并配以RevM10-Gal4 DB融合蛋白作為誘餌,便可用于篩選該RNA結(jié)合蛋白的cDNA克隆〔13〕.SenGupta 等利用RNA噬菌體衣殼蛋白能識(shí)別結(jié)合其基因組內(nèi)一種21核苷酸的RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特性,將RNA噬菌體衣殼蛋白與Lex DB域融合,構(gòu)建成可用于尋找體內(nèi)的RNA結(jié)合蛋白的酵母三雜交系統(tǒng)〔14〕.
核外雙雜交技術(shù) 在傳統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)中,蛋白之間的相互作用是在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生的.因此,它不能檢測(cè)某些在核外蛋白之間的相互作用.為了克服這種局限性,近年來(lái)有人建立了核外雙雜交技術(shù).其中SRS 和USPS就是這種技術(shù)的兩個(gè)代表.SRS也稱Sos蛋白召集系統(tǒng)(Sos Recruitment System).它的基本原理是分別將待測(cè)蛋白X與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的一種鳥(niǎo)苷交換因子(EGF)Sos蛋白融合；將Y蛋白與錨定在酵母細(xì)胞膜上的Src肉豆寇烯化信號(hào)蛋白融合,并使它們共表達(dá)于一個(gè)cdc25-2基因溫度敏感型突變的酵母菌株內(nèi).由于該菌株中cdc25-2基因編碼的EGF蛋白在36℃條件下不能激活細(xì)胞膜上的Ras蛋白,Ras途徑不通.所以細(xì)胞無(wú)法在36℃條件下生存.但如果待測(cè)蛋白X與Y之間發(fā)生相互作用就能把Sos蛋白帶到細(xì)胞膜上并激活附近的Ras蛋白,從而打通Ras途徑,使該菌株獲得在36℃條件下生存的能力.Aronheim等用此技術(shù)鑒別出了一些新的c-Jun相互作用蛋白,并分離到了一個(gè)AP-1抑制因子JDP2〔15〕.USPS也稱為基于遍在蛋白的裂解蛋白感受器(Ubiquitin-based Split Protein Sensor).它的設(shè)計(jì)是根據(jù)這樣一個(gè)事實(shí),即真核細(xì)胞中遍在蛋白與某一蛋白之間新生成的融合會(huì)被遍在蛋白特異的蛋白酶(UBPs)迅速切開(kāi),但這種切割只有當(dāng)遍在蛋白正確折疊時(shí)才會(huì)發(fā)生.研究發(fā)現(xiàn),遍在蛋白基因的N端和C端這兩部分即使分離,只要共表達(dá)與同一個(gè)細(xì)胞內(nèi),它們?nèi)阅苷_折疊.將待測(cè)蛋白X與帶有點(diǎn)突變的遍在蛋白N端片段融合,將待測(cè)蛋白Y與下游接有報(bào)告蛋白的正常遍在蛋白C端片段融合,并使它們共表達(dá)與同一個(gè)細(xì)胞內(nèi).因遍在蛋白N端片段內(nèi)含有點(diǎn)突變,它與C端片段之間不能自然形成正確的折疊.只有當(dāng)?shù)鞍譞和Y之間發(fā)生相互作用時(shí)才能克服點(diǎn)突變的影響,使遍在蛋白的兩端形成正確折疊,從而引來(lái)UBPs切除與C端片段連接的報(bào)告蛋白.此技術(shù)建立之初是通過(guò)Western blot檢測(cè)有無(wú)被切下的報(bào)告蛋白來(lái)判斷待測(cè)蛋白之間是否發(fā)生了相互作用的,所以操作比較繁瑣,不便于推廣〔16〕.最近有人對(duì)它作了改進(jìn),以一種融合的轉(zhuǎn)錄激活因子PLV作為報(bào)告蛋白.PLV一旦被從遍在蛋白C端片段上切下,它就會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)激活特定的報(bào)告基因,如：LacZ 和HIS3等.這樣就可以根據(jù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞是否生長(zhǎng)及顯色來(lái)判斷待測(cè)蛋白之間有無(wú)相互作用.因此極大地簡(jiǎn)化了操作步驟,提高了篩選效率〔17〕.
5 酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展與應(yīng)用的趨勢(shì)
在后基因組時(shí)代更具意義且更能發(fā)揮酵母雙雜交技術(shù)的領(lǐng)域是研究生命活動(dòng)中的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)〔18〕.第一個(gè)具有開(kāi)拓性的工作是Bartel利用酵母雙雜交技術(shù)建立了一個(gè)T7-噬菌體的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)圖(linkage-map)〔19〕.Fromont-Racine等對(duì)篩選到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定測(cè)序,并將它們分為5類,然后對(duì)其中的四類(非編碼序列除外)通過(guò)15輪的篩選與分析,繪制出一張綜合了酵母蛋白相互作用的全局性信息圖〔20〕.這是以往的實(shí)驗(yàn)所難以獲得的.
為適應(yīng)功能基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控研究的需要,CLONTECH公司在Merck-Washington大學(xué)的EST項(xiàng)目研究成果基礎(chǔ)上,采用了與傳統(tǒng)建庫(kù)方式完全不同的細(xì)胞內(nèi)同源重組方法,以高通量規(guī)模構(gòu)建了一種陣列模式的酵母雙雜交cDNA文庫(kù).它主要有以下特點(diǎn)：
(1)來(lái)源于多種組織器官和細(xì)胞系,因此含有幾乎所有基因的cDNA；
（2）所含各種cDNA的豐度趨于平衡；
（3)含有較長(zhǎng)的插入序列,但不是全長(zhǎng)cDNA序列.
這樣既避免了5’非編碼區(qū)可能存在的終止密碼阻礙融合蛋白的翻譯,又保證了表達(dá)出的蛋白構(gòu)象接近于天然.這種建庫(kù)方法不僅減少了工作量,而且在雙雜交中新發(fā)現(xiàn)的相互作用蛋白種類也明顯增多〔21〕.
最后,有必要指出的是,酵母雙雜交技術(shù)必須與其它技術(shù)結(jié)合才能有利于對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果作出更為完整和準(zhǔn)確的判斷.
酵母雙（單）雜交培養(yǎng)基現(xiàn)貨產(chǎn)品 |
