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改造免疫效應細胞以治療癌癥在過去的幾年里取得了巨大的進步，嵌合抗原受體（CARs）被廣泛用作重定向自體T細胞，可特異性針對淋巴白血病和淋巴瘤，且具有顯著的臨床結果。已被報道的重大突破即急性淋巴細胞性白血病（ALL），據(jù)報道在單次靶向CD19的CAR-T細胞進行化療之后，盡管有些病例中其細胞存活時間不長，總緩解率可達90%。（即使是在重度預處理的兒童和成年人中）早期試驗CD19-CAR-T細胞的良好成果使得目前有很多人努力爭取讓這門治療技術得到更廣泛的使用。

盡管如此，CAR-T細胞還是具有一些實際應用上的限制。為個人產(chǎn)生的自體移植的CAR-T細胞很難處理，也很難運用到廣泛的臨床層面。制作CAR-T細胞一般需要好幾周，這就使得它無法治療一些會迅速發(fā)展的疾病。但是，要從重度預處理的病人體內(nèi)收集足夠允許成功臨床運用的淋巴細胞（通常是淋巴細胞）也并非會總是成功。同種異體的“現(xiàn)成的”產(chǎn)物可以克服這個不足，雖然，通過原生α-Β T細胞受體（TCR）的異體T細胞（即使和人體白細胞抗原[HLA]匹配）具有移植抗宿主?。℅VHD）的重大風險。

NK細胞是高細胞毒性免疫因子，通過非特定的方式殺死他們的靶細胞。NK細胞沒有造成GVHD的潛質(zhì)，也提供了制作“現(xiàn)成的“同種異體的可用于免疫臨床治療的可能性，此外，正如報道所說，因為改造后的NK細胞仍會保留原本具有的抗體，當CAR-T細胞的特異性靶向抗原數(shù)量減少的時候，NK細胞仍具備通過其機制抗癌的能力，這在理論上可以降低癌癥復發(fā)的概率，CAR靶向抗原減少時的產(chǎn)生的耐藥性也可以得到減緩。因此，NK細胞的這種內(nèi)在特性使得NK細胞成為可幫助免疫治療的候選之一。通過基因改造引入抗原靶點來增加NK細胞的抗腫瘤翻譯是一個在癌癥免疫腫瘤學領域可深入研究的課題。

在本篇綜述中，我們針對NK細胞工程的最新進展，特別是關于NK細胞在基因改造后可能和T細胞一樣可以有效識別并殺死目標的臨床前證據(jù)進行描述。我們旨在討論引入CARs為主要的NK細胞和其他NK細胞系提供靶向抗體，定向改良NK細胞的挑戰(zhàn)性、臨床前以及早期臨床研究中支持以CARs改良過的NK細胞的效率的證據(jù)。

NK細胞是一種運用毒性快速對抗癌癥以及病毒感染細胞的無需抗原預先致敏的先天免疫因子，于是便有了“自然殺手“這一稱號。NK細胞調(diào)節(jié)的細胞毒性發(fā)生在無限白細胞抗原的情況下（HLA），這也是癌癥免疫療法中的理想情況，盡管NK細胞在遇到并識別人類白細胞抗原（HLA）蛋白后具有細胞毒性，這也被稱為獲得“許可”或NK細胞的學習過程。NK細胞的特點是不表達CD3/TCR復合物、缺少CD16和CD56膜抗原的表達。大多數(shù)NK細胞存在于外周血、肝臟、脾臟和骨髓中，在淋巴結中相對存在較少。

NK細胞的功能包括細胞脫粒、細胞因子的釋放、細胞毒性，由可識別細胞上配體的抑制受體、異二聚體C型凝集素受體[NKG2A]和激活受體（特別是自然殺傷受體[NCRs]NKp ] NKp46, NKp30, NKp44,以及C型凝集素激活受體 NKG2D7）接收到的信號之間的平衡來調(diào)控。這些受體也因此需要機制防止自己被無意識的激活進而對抗正常組織，即“自我耐受性”。 HLA類蛋白和KIRs（iKIRs）相結合傳遞抑制信號，進而使NK細胞的效應反應的過程被阻斷。通過一個所謂的“丟失自我”的假設概念，當成熟的NK細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槿狈LA的細胞，這個過程會發(fā)生在病毒或惡性轉(zhuǎn)化過程中，其表面的抑制性受體沒有被激活。在這個情況下，NK細胞也沒有收到抑制性信號。同時，在病毒或惡性轉(zhuǎn)化過程中會發(fā)生細胞應激和DNA受損，細胞應激激活NK細胞受體，使NK細胞殺死靶細胞。NK細胞可以通過分泌含穿孔素和顆粒酶，表達TNF家族因子來殺死腫瘤細胞，比如FasL和腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL），兩者通過各自受體的相互作用誘導腫瘤凋亡。此外，依賴抗體的細胞介導的細胞毒作用（ADCC）是通過與Fc受體CD16來調(diào)節(jié)的，這可以觸發(fā)NK細胞脫粒以對抗膜抗體靶細胞。缺少CD56的NK細胞高表達CD16，而高表達CD56的NK細胞低表達或不表達CD16（Fig.1）

NK細胞的快速殺傷能力和廣泛的細胞毒性使NK細胞具有致敏作用，使其可以被用作過繼治療。在體外，NK細胞通過細胞毒性可對抗多種血液惡性腫瘤，其中有AML、ALL、MM（急性髓細胞白血病，急性淋巴細胞性白血病，多發(fā)性骨髓瘤）以及一些固體腫瘤，其中有神經(jīng)母細胞瘤，卵巢癌、結腸癌、腎細胞癌（腎癌）和胃癌。然而，許多腫瘤都有其避免被NK細胞殺傷的策略。舉個例子，一些白血病和淋巴瘤細胞表達維持HLA蛋白的高表達，從而避免他們被NK細胞攻擊，或者缺少激活NK細胞受體的信號配體。因此，許多團隊探索可提高NK細胞活性的策略，包括使用細胞因子和人工抗原呈遞細胞（APCs）蛋白共刺激作為以促進增殖。在細胞因子進一步的孵化中，特別是IL-2,IL-5，NK細胞獲得了溶解新鮮的和培養(yǎng)的腫瘤靶點的能力，這些靶點通常對于NK細胞的溶解作用是不敏感的。

另一個策略是于單克隆抗體聯(lián)合治療以提高ADCC。NK細胞有許多來源，這也可從多個團隊的證明中得知。盡管擴增、活化的自體NK細胞的過繼治療在臨床試驗中安全、具有耐受性，但其療效依然有限。這可能和HLA的自體抑制有關。來自同種異體源的NK細胞為免疫治療提供了一個有希望的選擇?；钴S的NK細胞具有的最有前景的特征是他們具有在不導致GVHG的情況下促進移植對抗白血病、腫瘤Gvl、GvT），以及采用預處理和移植后設定的過繼運輸同等位基因的NK細胞的臨床研究。過繼轉(zhuǎn)移同種異體NK細胞在血癌和固體腫瘤中是安全的，盡管他們的臨床活動比較溫和。許多團隊，包括作者，正在探索通過基因改造進一步提高NK細胞殺死腫瘤能力的策略。

CARs可用于改造可通過體白細胞抗原在腫瘤表面識別抗原并殺死其目標的免疫效應細胞。CARs是胞外抗原結合區(qū)域，通常是來源于單克隆抗體和細胞內(nèi)信號域的單鏈可變片段（scFv），一般是TCR的CD3ζ鏈。CARs在臨床上被用于直接、特異的改造T細胞，關于CAR-T細胞的研究也。不管怎樣，靶向CD19的CAR-T細胞有著迅速的反應和持續(xù)的對于淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤的緩解作用，特別是急性淋巴細胞性白血?。ˋLL），這也激發(fā)了在臨床對進一步研究和優(yōu)化CAR-NK細胞的熱情。

相比CAR-T細胞，使用CAR-NK細胞有著其他的優(yōu)點。比如說，過繼治療時采用自體和同種異體的NK細胞在體內(nèi)的持久性是有限的。缺乏克隆增殖的NK細胞以及免疫介導的對NK細胞的排斥作用使得在幾天內(nèi)或者幾周內(nèi)不大可能出現(xiàn)釋放綜合征(CRS)。。而且，盡管一部分病在接受了CAR-T細胞之后沒有出現(xiàn)GVHD（移植抗宿主?。?/span>，大部分CAR-T細胞研究還是使用了同種異體的T細胞。因為同種異體的T細胞（即使是可和人體白細胞抗原結合的）通過原生α-Β T細胞受會造成移植抗宿主病。而NK細胞不會引起GVHD（移植抗宿主病），這一點已經(jīng)通過患有血癌及固體惡性腫瘤患者的單倍體和臍帶血（CB）NK細胞的融合得到了證明。因此，NK細胞提供了生產(chǎn)現(xiàn)成同種異體的可立即用于臨床使用的產(chǎn)品的機會。此外，比起CAR-T細胞，CAR-NK細胞可以通過他們識別和靶向腫瘤細胞的天然受體保留其潛力，相比T細胞，NK細胞靶向CAR的抗原下調(diào)更少。有一種潛在的提高NK細胞能力的方式，即捐贈和KIR受體不匹配的CAR-NK細胞，或是基于單倍體B KIR基因含量的細胞，兩者都有利于同種異體細胞的轉(zhuǎn)移。

以前不愿意使用NK進行CAR改良治療的原因很大程度上是因為不確定它的遷移和滲透腫瘤組織的能力，以及對于CAR-T細胞還不夠有信心。這樣的想法也和NK細胞在體內(nèi)的持續(xù)性時間有限相關，持續(xù)時間短雖然保證了NK細胞的安全性，但也限制了它的功效。此外，現(xiàn)在有關基因改良NK細胞的技術還不夠成熟，T細胞利用腺病毒傳導的成功也對比出了不同水平下NK細胞傳染的低可行性。但是，最近有關病毒性傳導和電穿孔的技術，又重燃了對NK細胞基因修飾的熱情。也許現(xiàn)在最大的挑戰(zhàn)并不是發(fā)展合適的CAR療法，暫且不論效應細胞的來源，最大的挑戰(zhàn)應該是很難找到合適的免疫靶抗原。理想的免疫靶抗原應該是能被所用腫瘤細胞表達的而正常組織不表達或極少表達的，這樣才會使其僅僅針對于腫瘤細胞發(fā)生作用。

NK細胞主要來自于外周血、臍帶血（CB）、或造血干細胞祖細胞（HSCPs），NK細胞系被成功的修飾并表達CARs以對抗靶細胞，其中很多使用了CAR-T細胞，CAR-NK細胞在體內(nèi)或體外殺死腫瘤靶細胞時都是高效率的，盡管迄今還沒有關于使用CAR-NK細胞治療的臨床數(shù)據(jù)的相關報道。

NK細胞過繼治療的研究可以從幾個不同的來源來研究.80而自體NK細胞可以在體外可重復產(chǎn)生，它們在對抗自體腫瘤時活性有限，可能不是很容易通過改造細胞表達CAR來克服這一缺陷的. 同種異體NK細胞可以從健康的捐贈者的PB中產(chǎn)生或從CB中擴大出來。

無論來源如何，擴大的、活化的CB或PB衍生的NK細胞都有許多特征，使它們成為基因修飾的有用的效應物。擴大，活化的NK細胞通常表達一系列活化受體，包括CD16，NKG2D和NCR（NKp44 NKp46），盡管捐助者的捐助者的變化。這些活化的NK細胞配備著KIR和 “殺人執(zhí)照” 。它們在體內(nèi)擴增和持久力，雖然不如轉(zhuǎn)移T細胞，卻與血液系統(tǒng)惡性腫瘤的抗腫瘤活性等試驗存在明顯聯(lián)系，如AML。此外，體外擴增原代人NK細胞能比T細胞產(chǎn)生不同光譜的細胞因子，包括：干擾素（IFN）-γ，IL-3其中G、細胞和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF），這可能與CRS的低風險相關。如上所述，與CAR修飾的NK細胞，絕大多數(shù)仍停留在經(jīng)驗的基礎上，結合CAR改裝初級人類NK細胞將對一些血液和實體腫瘤抗原，如CD19、CD20、GD2，和HER-2重新靶向治療。

許多CAR-NK細胞最初的臨床前的研究主要集中針對帶有抗CD19和CD20-CARs惡性B細胞腫瘤。雖然淋巴細胞缺失后再輸注cd19-car-t細胞導致患者CD19+腫瘤復發(fā)或惡性劇烈反應，但是伴有BL復發(fā)的患者反應則不強烈。 因此，制定針對BL中的CD20的第二代靶向CD20 NK-CAR蛋白，并利用mRNA轉(zhuǎn)染產(chǎn)生。這抗-CD20-4-1BB-CD3ΖCAR被用于基因修飾來自健康獻血者中的PB NK細胞，，其在基于K-562飼養(yǎng)細胞系的存在下被激活，并表達IL-15和4-1BB配體（K562-MBIL15-41BBL）。在CAR mRNA轉(zhuǎn)染僅僅16小時后，50%–95%的擴增的PB NK細胞表達CAR蛋白，并且相比于只用利妥昔單表現(xiàn)出顯著增強的體外對抗利妥昔單敏感和耐藥的BL細胞的細胞毒活性。，同時延長Raji移植小鼠生存。非病毒轉(zhuǎn)染、電穿孔技術介導的表達可以產(chǎn)生強大的CAR介導的殺死，這些CAR蛋白的短暫活性特性會很可能決定在臨床上需要重復注射治療。

我們組最近開發(fā)出一種新的方法來產(chǎn)生CAR-CD19+ NK細胞的，我們認為解決了所有上述限制。我們用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（IC9 /CAR。19、IL15）來修飾CB來源的NK細胞，這樣（1）與CAR CD19基因重組重新特異性的靶向CD19；（2）異位產(chǎn)生細胞因子IL-15這對NK細胞的存活和擴增至關重要。（3）表達自殺基因，誘導caspase-9（ic9）藥理活性，必要時可消除轉(zhuǎn)導的細胞。這些基因修飾使工程NK細胞維持足夠數(shù)量，并在異種移植小鼠模型中保持強大的有效殺滅B細胞白血病或淋巴瘤細胞的功能。

盡管如此從初級NK細胞報告中必須考慮到捐贈者，修飾細胞的轉(zhuǎn)染方法（病毒或非病毒轉(zhuǎn)染）以及不同的擴增方式對于內(nèi)在固有的NK細胞功能的很大的差異性。而多數(shù)臨床前報告由于它們廣泛的轉(zhuǎn)染效率，效率范圍從1%-90%，在原代NK細胞利用逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體進行轉(zhuǎn)染。慢病毒轉(zhuǎn)導蛋白相對于逆轉(zhuǎn)錄病毒具有獨特的優(yōu)勢。它不需要活性的分離的細胞株，這使得轉(zhuǎn)染原代以及非激活的細胞成為可能。（盡管在非擴張NK原發(fā)性細胞被使用的很少）。盡管逆轉(zhuǎn)錄或病毒載體是被用來通過講外源基因整合到宿主細胞基因組上確保轉(zhuǎn)基因持久性表達，一些非病毒的轉(zhuǎn)染方法也給一一研究出來。這些方法包括電穿孔，使得CAR編碼的mRNA通過細胞膜上的微孔轉(zhuǎn)染進去。使得CAR蛋白瞬時表達。然而考慮到電轉(zhuǎn)與單純的慢病毒轉(zhuǎn)染使得PB或CB誘導的NK細胞顯著的低轉(zhuǎn)染率（在同一報道中分別＜10%和＜30%），逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導蛋白可能更適用于用來對原發(fā)性或CB NK細胞進行修飾。針對這一問題可能解決的辦法是在引發(fā)誘導干細胞（iPSCs）以及隨后的成熟NK細胞分化過程中，接下來討論了其他來源的NK細胞的情況。表一總結了迄今為止利用原代CAR NK細胞的臨床前試驗研究。

盡管支持使用擴增的，活化的CAR-NK細胞取得了令人鼓舞的數(shù)據(jù)，大多數(shù)發(fā)表的研究報告利用NK細胞系表達CAR蛋白。雖然存在幾個NK細胞系（NKG，YT，NK-YS、HANK-1、YTS細胞、NKL細胞），研究最廣泛的是NK-92，一個人類NK樣細胞系最初是從一個非霍奇金淋巴瘤（NHL）病人那里建立的。NK-92細胞缺乏幾乎所有KIRs抑制子除了KIR2DL4。在NK-92中缺乏的KIRs細胞可能至少部分地解釋了它們在體外針對廣譜腫瘤靶點的顯著活性。⁸有希望的體外實驗結果使得NK-92細胞早期被用于超過40種人類惡性腫瘤。然而，盡管重復注射的NK-92細胞比較安全，效果仍然有限；因此，許多團隊正在探索利用CAR改裝以提高這些細胞的抗腫瘤活性的使用。

基因改造有許多理論上的優(yōu)勢。NK-92細胞系優(yōu)于原代NK細胞。其是一個已建立好的具有依據(jù)標準冷凍保存細胞庫的操作方法能成功復制和擴增的同質(zhì)細胞系的特征。是一個能持續(xù)擴增的細胞系并且具有“無限”的數(shù)量，使NK細胞在CAR治療中擁有足夠的代數(shù)與有用的數(shù)量。近年來，一些團體，修飾了NK-92細胞表達不同的CARs來針對血液和實體惡性腫瘤，包括CD19和CD20的B細胞白血病/淋巴瘤，CD38和CS-1多發(fā)性骨髓瘤、和HER-2上皮腫瘤、 CAR修飾的NK-92細胞也可以通過瘤內(nèi)注射，使它們能夠傳播到腫瘤部位。并發(fā)揮他們的作用是通過類似疫苗的機制。此外，轉(zhuǎn)導效率在原發(fā)性NK細胞中有很大差異，當轉(zhuǎn)導NK-92時，CAR的表達與其轉(zhuǎn)染效率有更一致相關性，這大部分歸因于其細胞系的同質(zhì)性。轉(zhuǎn)導NK-92細胞效率平均約50%，即使使用非病毒方法如電穿孔轉(zhuǎn)染或核酸轉(zhuǎn)染。

雖然一些研究已經(jīng)證實了作為大規(guī)模擴增和使用NK-92細胞作為異基因細胞免疫療法的安全性與可行性。 NK-92細胞有固有的缺點必須加以考慮。臨床上最顯著的缺點包括他們潛在的致瘤性（因為NK-92細胞來自NHL患者），多種細胞遺傳學異常和潛伏感染Epstein Barr病毒（EBV）。因此，為安全起見，NK-92細胞在進入臨床使用之前要經(jīng)過X照射。之前多數(shù)團隊認為，1000個劑量的輻射足夠使得植入的NK—92細胞對體外細胞毒性的影響最小。輸液前的輻射處理很可能會對它們在體內(nèi)的增殖，持續(xù)能力和長期的抗腫瘤作用產(chǎn)生負面影響。 CAR-T細胞的效用是由其持久性決定的，同樣，體內(nèi)NK細胞過繼輸注療效已依賴于它們在體內(nèi)的擴增與持久能力。此外，我們已經(jīng)在淋巴瘤小鼠模型中證明了在表達CAR的 NK細胞體內(nèi)的持久性對有效的持久的抗腫瘤免疫的重要性，重復注射輻射后的NK-92細胞是可行的，可作為一種手段規(guī)避他們有限的持久性，但是這樣一種方法很可能會誘發(fā)異基因細胞系抗體和細胞免疫以及每次輸注后更快的排斥反應。此外，NK細胞缺乏幾種典型的活化表達受體（例如，NKP44和NKP46110120），他們不表達內(nèi)源性Fc受體，因此不能調(diào)控ADCC。為了克服后者的缺點，一NK-92細胞衍生表達fcrRⅢ高親和力的變種已經(jīng)被發(fā)展起來，這種高親和變異也被證明在原代NK細胞是有用的，因為只有10%的人口自然攜帶這種多態(tài)性。表2總結了CAR修飾的NK細胞株的臨床前研究結果。

另一種適合CAR表達的NK細胞來源是人類多能干細胞（hPSCs）。人類胚胎干細胞（胚胎干細胞）和誘導多能干細胞（iPSCs）可以無限期地保存并提供幾乎無限NK細胞的供應。最近有一份實驗方法針對從冷凍CB分離出人CD34 + HPSCs 再對NK細胞進行分化，然后將其修飾表達CD19-CAR蛋白。該團隊還描述了無飼養(yǎng)層方法：利用胰島素樣生長因子1從hPSCs中收集基因修飾過的NK細胞。，這種方法有可能被用來作為一個平臺來表達其他的CAR蛋白。

所有的car-nk構建到目前為止討論是細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導鏈cd3ζ，它針對表面表達的腫瘤相關抗原的細胞.賦予特定的細胞毒作用。另一個吸引人的戰(zhàn)略是發(fā)展car-nk細胞靶向活化的NK受體如NKG2D受體，NKG2D配體包括主要組織相容性復合體（MHC）I類鏈相關發(fā)展目標配體（MICA），MICB，和幾個UL-16-結合蛋白（ULBPs），它們在多種腫瘤細胞和病毒感染的細胞表面高表達。因此， NKG2D CAR具有潛在識別大約90%的人類腫瘤類型的功能^.126這種方法的其他好處是， CAR不僅識別腫瘤細胞也識別NKG2D配體表達的免疫抑制細胞，如髓源性抑制細胞（MDSCs）與調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）。然而，NKG2D配體也在各種生理條件下誘發(fā)的，如炎癥。這引起了人們對“靶標/非腫瘤”毒性的關注。雖然NK細胞通常表達NKG2D，但表達NKG2D的CAR相比于內(nèi)源性NKG2D受體能大大提高他們的活性。NKG2D缺乏胞漿區(qū)的信號模體及其連接信號轉(zhuǎn)導是通過DNAX激活磷酸化蛋白10（DAP10），從而招募下游信號效應蛋白和誘發(fā)細胞毒性^.為了測試超生理激活信號是否可以提高NK介導的細胞毒性、常等。用DAP10 與NKG2D / CD3ζCAR在來源于不同的惡性腫瘤多個細胞系中共表達用來檢測NK細胞活性，ALL，骨肉瘤，前列腺癌和橫紋肌肉瘤中表現(xiàn)出最好的反應。全部這種策略的一個缺點是在一些原發(fā)性惡性血液病中激活配體存在下調(diào)或丟失，這可能會影響NKG2D介導的細胞毒作用。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)，NKG2D配體的表達和NKG2D-DAP10—cd3ζ受體介導的細胞整體水平毒性作用兩者之間沒有顯著的相關性。

為了建立一種CAR能通過另一條路線去激活NK細胞、托普弗等130在中納入DNAX激活蛋白12（DAP12）作為一種細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導結構域，以及前列腺干細胞抗原（PSCA）單鏈抗體（來源于雜交瘤7F5）這兩個因素。DAP12在NK細胞中表達與一系列的受體激活相關，包括C型凝集素受體NKG2C，自然細胞毒性受體NKp44，和激活KIRs KIR3DS1與KIR2DS1/2/5，在體外和在小鼠模型中，抗PSCA-DAP12 CAR能夠在原發(fā)性NK細胞和NK細胞系YTS中表達并能溶解其他抗PSCA+ B/C和HLA-C配型的腫瘤細胞。有趣的是，YTS NK CAR與DAP-12信號域組合與單獨的抗-PSCACD3Ζ-CAR NK細胞相比其特異性殺傷力有所提高。據(jù)我們所知，這項工作是展示一個免疫受體酪氨酸活化模體（ITAM）- 包含DAP12 CAR與作為一個以cd3ζ為基礎的CAR一樣對啟動激活下游的信號有效，其中包含三個ITAMs。重要的是，在體外激活和發(fā)揮細胞毒性上，這DAP12信號的CAR不需要額外的共刺激信號蛋白，作者推測這對于的DAP12介導NK細胞的活化是沒有必要。

除了CAR修飾，另一種有前途的治療策略包括改造NK細胞表達已知對促進NK細胞的細胞毒性是非常重要的細胞因子。這種方法還可以提高NK細胞的持久性和不需要在補充體內(nèi)細胞因子的有毒操作。然而，一個顯而易見的問題是誘發(fā)CRS和其他的細胞因子誘導的全身毒性。還有一個遠大于理論的風險在誘導惡性轉(zhuǎn)化中的轉(zhuǎn)導的細胞存在持續(xù)的自分泌刺激，這種現(xiàn)象在 IL-2-改造的 T細胞被觀察到。我們團隊試圖通過短暫的IL-2和IL-15編碼轉(zhuǎn)染來避免細胞毒性利用一種短暫的（穩(wěn)定）的表達模式如NK細胞mRNA電穿孔轉(zhuǎn)染。

盡管CAR-NK細胞有前途的臨床結果，并且其未改性NK細胞也已建立安全說明以及最近在臨床上成功使用CAR-T細胞，但截至2016年12月，只有兩CAR-NK的細胞治療的臨床試驗有積極療效的患者（NCT00995137 ST.JUDE兒童研究醫(yī)院NCT01974479從國家大學健康系統(tǒng)，新加坡）。這兩個試驗是針對難治性CD19+ALL患者并攜帶同樣的第二代抗CD19CAR與4-1BB共刺激域（anti-cd19-bb-ζ），將其轉(zhuǎn)染入單倍型相合供體NK 細胞。而圣裘德試驗只對兒科病人開放，不接受注冊。新加坡的試驗正在積極招收兒童和成人。在這劑量遞增試驗，兒科和成人患者接受單一靜脈注射（IV），按照0.5×107到1× 108 CD56+細胞/公斤輸注抗-CD19-BB-ζ NK細胞。這些臨床結果等待進一步研究。

在過去的幾個月里，一些涉及car-nk其他試驗細胞治療已在ClinicalTrials.gov登記過。Persongen的生物療法，立足于中國，獲得監(jiān)管部門的批準進行幾次試驗以控制第三代的連續(xù)劑量（相關scFv附著TCRζ，CD28和4-1BB信號結構域）CAR轉(zhuǎn)染NK-92細胞（0, 3，5天）。這個團隊的目標是難治性CD7+白血病/淋巴瘤成人患者（NCT02742727），CD33 +髓系惡性腫瘤的兒童和成人患者（NCT02944162），難治性兒童和成人CD19+惡性腫瘤并計劃接受造血干細胞移植患者（HSCT）（NCT02892695）。該小組還針對MUC1+復發(fā)和難治性實體腫瘤（NCT02839954）。我們組還計劃進行臨床研究，以檢驗CB誘導的NK細胞逐步增大的劑量的安全性和有效性。在2017年初其被改造并在復發(fā)或難治性B淋巴細胞惡性腫瘤患者表達IC9.CAR19.CD28-ζ-2A-IL-15。

在CAR-NK治療可以擴展到更大的患者隊列中之前還有一些科學問題和監(jiān)管障礙有待解決。雖然關于NK細胞有強而有力的方法描述了其的分離、擴增和轉(zhuǎn)導，制備細胞仍然是很繁重。與慢病毒結構相比，逆轉(zhuǎn)錄病毒結構具有更高的轉(zhuǎn)導效率，但也攜帶較高突變插入的潛在風險，這種風險，這在很大程度上仍然是理論上的（除了在X連鎖嚴重聯(lián)合免疫缺陷患者中的人群中）[SCID]，Wiskott Aldrich，或慢性肉芽腫性疾病中），因此來在人類使用此治療之前將有不同的監(jiān)管調(diào)控阻礙。電穿孔法，除了在技術上更簡單和更嚴格監(jiān)管，還能避免使用病毒載體和致癌基因的相關風險以及激活和插入突變.然而，有些團隊報告的用臨床級別的電穿孔儀在體外NK-92的轉(zhuǎn)染效率可達80%–90%的大多數(shù)發(fā)表的報告中顯示原代NK細胞體外擴增的的研究是令人失望的，轉(zhuǎn)染效率低至10%，而且，CAR蛋白的表達只有短暫的活性，通常是持續(xù)<7天，137天，這可能會對CAR-NK細胞長期療效產(chǎn)生負面影響。而很少有報告公開探討轉(zhuǎn)導對NK細胞生存力、表型和功能的影響，現(xiàn)有的數(shù)據(jù)表明轉(zhuǎn)導對這些因素的影響微乎其微。

還需要探討的另一個概念是淋巴細胞缺失治療是否是預防同種異體CAR NK細胞的排斥反應所必須的。除了誘導淋巴細胞減少，淋巴細胞化療法在腫瘤微環(huán)境中清除其他免疫細胞如Treg和MDSCs，這可能會對NK細胞的細胞毒性或其在體內(nèi)擴增產(chǎn)生負面影響。最后，鑒于最近關于注射CAR修飾的T細胞的安全問題，是否要將自殺的系統(tǒng)（例如，基于caspase-9和胸苷激酶）納入到基因修飾結構中考慮。

另外一個未解答的問題包括是否重復注射能引發(fā)的免疫原性，特別是由于大多數(shù)的scFvs是鼠抗，并可能引起人抗鼠抗體（HAMAs）或細胞介導的排斥/致敏作用。隨著CAR-T細胞注射后，HAMA免疫原性的研究得到了廣泛的研究。在CAR-T細胞的研究中，它不是一個重要的問題，可能是因為大多數(shù)患者都單次輸注自體細胞。較少的報告討論了細胞介導的反應，在這種情況下，使用同種異體NK細胞可能使這個問題變得不那么理論化反而更實用。

進一步研究探索最佳的載體、構建和轉(zhuǎn)導方法對于免疫治中識別“完美的NK CAR”是必要的。

未來幾年將為基因改造NK細胞提供臨床驗證，并有可能形成免疫療法的未來。更多組合技術將被測試以提高NK細胞治療的腫瘤特異性，無論是通過利用NK細胞固有的能力，抑制或敲除免疫監(jiān)管點，或針對腫瘤微環(huán)境。目前正在研究的過繼性T細胞治療引入額外基因編輯技術，如CRISPR/Cas9和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應核酸酶（TALEN），也將被用于在NK細胞的改造中，有一些團隊顯示了這些技術的臨床前可行性（納瓦羅，2016，自然免疫學會，會議）。這樣的策略伴隨著對他們自己的重大監(jiān)管，并且到目前為止，只有一項臨床試驗中使用這項技術，并在積極招募患者，雖然針對NY-ESO1和PD-1試驗在不斷發(fā)展。

盡管仍有許多問題， CAR-NK細胞有望成為一種新的治療難治性惡性腫瘤的細胞免疫療法。值得注意的是，NK細胞可以產(chǎn)生一個現(xiàn)成的產(chǎn)品，可作為治療患者的同一性質(zhì)產(chǎn)品，消除那些個性化和特定病人治療物的需要，這是當前CAR-T細胞治療缺陷。NK細胞介導的細胞毒性能更通過表達CAR更有效地直接對難治性腫瘤，這可能有助于癌癥治療的新范式的轉(zhuǎn)變。

參考文獻：

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