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周愛華(云南省楚雄州人民醫(yī)院藥劑科，楚雄675000) 摘要：目的：〖HTK〗探討影響鱟試驗(yàn)準(zhǔn)確性的干擾因素和處理方法。方法：通過對(duì)干擾鱟試驗(yàn)準(zhǔn)確性干擾因素的分析(包括鱟試劑本身、操作條件、配制原料等)，提出了鱟試驗(yàn)中應(yīng)注意的問題。結(jié)果：只要克服了檢查中的干擾因素，鱟法具有比家兔法更簡便、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。結(jié)論：凡不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查或雖有干擾但可克服的注射劑藥品，均可用鱟法代替家兔法檢查其熱原。 關(guān)鍵詞：鱟試驗(yàn)；熱原；家兔熱原檢查法；注意事項(xiàng) 中圖分類號(hào)：R92712文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：1006-0111(2000)03-0162-02 鱟試驗(yàn)是利用鱟的變形細(xì)胞與微量內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的現(xiàn)象，作為判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素限量是否符合規(guī)定的一種方法[1]。它具有比家兔法更簡便、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。中國藥典1995年版已收載細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法(簡稱鱟試驗(yàn))，但只用于幾種輸液的檢查。根據(jù)現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)證明，凡不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查或雖有干擾，但可以克服的藥品注射劑，將能夠全部以鱟法代替家兔熱原檢查法。但是該法受到許多因素的影響，故在做鱟試驗(yàn)檢查時(shí)，應(yīng)注意下列問題。 1鱟試劑本身 1.1鱟試劑靈敏度為了保證檢查細(xì)菌內(nèi)毒素結(jié)果的準(zhǔn)確性，用于試驗(yàn)的鱟試劑應(yīng)首先核對(duì)靈敏度。因?yàn)樵谖覀兊膶?shí)際工作中，發(fā)現(xiàn)鱟試劑均符合藥典規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)前提下，由于生產(chǎn)廠家不同，部分鱟試劑的實(shí)測(cè)靈敏度與標(biāo)示值有差異而導(dǎo)致檢測(cè)同一檢品時(shí)，用相同標(biāo)示值的鱟試劑，出現(xiàn)不同結(jié)果。因而先核對(duì)靈敏度可避免因鱟試劑本身造成的判斷失誤。建議法定部門和生產(chǎn)單位應(yīng)注意鱟試劑的質(zhì)量檢查。 1.2供試品稀釋在取樣品時(shí)，一定要熟悉中國藥典的內(nèi)容，不能直接取大輸液原液0.1ml進(jìn)行檢查，這是排除干擾因素的簡單有效的方法。因藥典已明確規(guī)定試驗(yàn)中鱟試劑的靈敏度不超過0.5EU/ml，根據(jù)供試品的稀釋公式：供試品稀釋倍數(shù)=L/λυL：供試品的內(nèi)毒素限量(1EU/ml)λυ：鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值(EU/ml)故檢測(cè)大輸液均應(yīng)稀釋后才能進(jìn)行試驗(yàn)，如選用更高靈敏度的鱟試劑，則應(yīng)增加樣品的稀釋倍數(shù)。稀釋用的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水藥典作了規(guī)定。在4h內(nèi)不得與鱟試劑產(chǎn)生凝集反應(yīng)。 如果直接用供試品原液試驗(yàn)，就會(huì)使供試品的內(nèi)毒素提高到0.5EU/ml或0.5EU/ml以下，這樣，根據(jù)目前大輸液的生產(chǎn)和貯藏條件，有些就會(huì)達(dá)不到，鱟法檢出的陽性率會(huì)提高，兔法復(fù)核的機(jī)遇也將增多，勢(shì)必會(huì)浪費(fèi)人力物力。 2操作條件 2.1操作熟練程度操作時(shí)嚴(yán)格按無菌操作法進(jìn)行，安瓿開啟前應(yīng)先用砂石劃痕(不管是色點(diǎn)或包環(huán)易折安瓿)，用手半拉半掰將頸部折斷，防止碎玻屑掉入安瓿內(nèi)及有一個(gè)比較整齊的頸口。在鱟試劑的溶解、樣品的稀釋及加入時(shí)，取樣均應(yīng)準(zhǔn)確量取。操作時(shí)，雙手避免在安瓿或試管的上方來回移動(dòng)，加樣后迅速封閉管口，并立即放入恒溫水浴箱中，且整個(gè)操作過程中時(shí)間應(yīng)緊湊，防止微生物的污染，否則易致假陽性的出現(xiàn)。 2.2混合液的pH值供試液與鱟試劑混合液的pH值對(duì)鱟試驗(yàn)的影響較大，根據(jù)國內(nèi)外資料的報(bào)道，試驗(yàn)的最適pH為6.25～7.25才能形成最佳凝膠[2]。而藥典規(guī)定各種葡萄糖注射液的pH為3.2～5.5，我院控制在3.7～42之間。我們?cè)鴮?duì)pH值小于4.0的多批次葡萄糖注射液作了調(diào)pH和不調(diào)pH的比較試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該pH范圍內(nèi)兩者無顯著差異，不調(diào)pH者陰性抑制試驗(yàn)仍可得到堅(jiān)實(shí)的凝膠，說明不影響反應(yīng)靈敏度，且鱟試劑本身具有一定的緩沖能力。但pH值過大或過小均可抑制鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)，其原因可能是pH值過大或過小均可破壞極微量的內(nèi)毒素。 2.3保溫溫度將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成1EU/ml，進(jìn)行鱟試驗(yàn)，然后分別放置于25、28、31、34、37、40、43、46、49℃水浴保溫。實(shí)驗(yàn)中觀察到凝膠形成的速度隨著溫度的升高而加快，但到達(dá)49℃保溫90min也未出現(xiàn)凝膠。 從實(shí)驗(yàn)可以看出，溫度對(duì)鱟試劑的靈敏度影響很大，保溫溫度在25～40℃之間，隨著溫度的升高，鱟試劑的靈敏度亦增大，在40～46℃之間，溫度對(duì)鱟試劑的靈敏度無明顯影響，達(dá)到49℃或更高溫度時(shí)，則會(huì)破壞鱟試劑。故應(yīng)嚴(yán)格按照藥典的要求，溫度控制在(37±1)℃之間，才可獲得理想的結(jié)果。 2.4保溫時(shí)間將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成1EU/ml，進(jìn)行鱟試驗(yàn)，37℃水浴保溫，分別在10、20、30、40、50、70min時(shí)觀察，發(fā)現(xiàn)凝膠形成的堅(jiān)實(shí)狀態(tài)隨著時(shí)間的延長而堅(jiān)固。 從上述實(shí)驗(yàn)可以看出，延長保溫時(shí)間，可以提高鱟試劑的靈敏度，增加假陽性。故應(yīng)遵守我國藥典規(guī)定的保溫(60±2)min時(shí)間。 2.5在鱟試驗(yàn)過程中應(yīng)防止試管受到振動(dòng)鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素形成的凝膠受到振動(dòng)后易變形而誤判為陰性。因此，在鱟試驗(yàn)過程中，不宜進(jìn)行容易引起試管振動(dòng)的實(shí)驗(yàn)操作，試驗(yàn)用的試管架的眼孔直徑應(yīng)與安瓿或試管直徑相接近，避免安瓿或試管左右晃動(dòng)。水浴箱要放置在固定不易受到振動(dòng)的地方，保溫過程中不可隨時(shí)取出觀察。 3其它 3.1配制的原料在鱟試驗(yàn)檢測(cè)中，0.9%氯化鈉注射液多次出現(xiàn)假陽性反應(yīng)，對(duì)此進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)工作，查找原因，發(fā)現(xiàn)陽性率高與廠家原料有關(guān)。筆者把不同廠家生產(chǎn)的氯化鈉原料配制的0.9%氯化鈉注射液，對(duì)不能通過鱟法檢查的送藥檢所用兔法檢查，結(jié)果為陰性，其中個(gè)別廠家的陽性率高于其它廠家，為此將不同廠家的氯化的原料分別在230℃烘焙1h后進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)個(gè)別產(chǎn)品色澤明顯變黃。按中國藥典1995年版附錄規(guī)定的易炭化物檢查，分別將不同廠家的氯化鈉原料進(jìn)行易炭化物相對(duì)照檢查，結(jié)果上述明顯變黃廠家的氯化鈉色澤較深。因此認(rèn)為個(gè)別廠家的注射用氯化鈉原料含有較多的有機(jī)雜質(zhì)，希望廠家要控制好質(zhì)量。另外，在葡萄糖原料中偶有存在著β-D聚葡糖的現(xiàn)象，它與鱟試劑發(fā)生凝集反應(yīng)，但注入兔體內(nèi)不能使其升溫，故造成假陽性，所以最好是使用定點(diǎn)廠家合格的葡萄糖原料。 3.2所用器皿均應(yīng)徹底洗凈和滅菌安全實(shí)驗(yàn)用器皿均應(yīng)充分洗滌并沖洗干凈，特別是接觸酸堿或用洗衣粉、洗液等洗滌后，更應(yīng)沖洗干凈，以免殘留物破壞極微量的內(nèi)毒素。滅菌應(yīng)按藥典中的有關(guān)方法處理，防止引入外源性內(nèi)毒素。如有條件的話可用合格的細(xì)菌內(nèi)毒素快檢盒。 3.3陽性對(duì)照我國藥典規(guī)定鱟試驗(yàn)必須做陽性對(duì)照，其目的就是證實(shí)實(shí)驗(yàn)條件下鱟試劑的活性，所以在實(shí)驗(yàn)過程中，陽性對(duì)照如為陰性，此次試驗(yàn)無效，應(yīng)重新復(fù)做。另外細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)稀釋，不可放置后再用。 參考文獻(xiàn)： ［1］王茂林鱟試劑法檢查熱原的應(yīng)用范圍［J］中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，1990，10(1)：41 ［2］高國政，顏錦pH值影響細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定的實(shí)驗(yàn)室研究［J］中國藥學(xué)雜志，1998，33(3)：162 收稿日期：1999-11-29
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